人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

0　引言2 0世纪 90年代起 ,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手 ,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要 [1] .我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体 ,其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段 .找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义 .利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建c DNA文库 [2 ] ,继而进行筛选、克隆等 .我们选取与几株单抗的免疫荧光及 Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株 HHCC作为建库材料来源 ,以λgt11DNA为载体 ,构建了人肝癌细胞 c DN…     

肝癌cDNA文库的构建和IGF—Ⅱ基因的克隆

以5例原发性肝癌组织的pay(A~+)RNA构建一个1×10~6的混合肝癌cDNA文库,并以正常人肝IGF-Ⅱ基因片段为探针筛选此文库,得到多个阳性克隆,从中再以一个较长片段的克隆作为探针对其它组织作Northern杂交分析,发现胎脯、胎肝及其它肝癌组织中的IGF-Ⅱ基因都有过量表达,而正常成年肝组织无明显表达。     

人胃癌组织cDNA文库的建立

随着DNA重组技术的发展,某些与细胞癌变有关的基因的分离与克隆越来越受到人们的重视。我们建立了人胃癌组织的cDNA文库,希望能从该文库中分离出与胃癌变有关的基因。     

人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用．近年来，随着分子生物学技术的发展，cDNA文库构建方法有了很大改进和提高．就cDNA文库构建的方法作一综述，     

北京鸭肝组织cDNA文库的构建及ApoAIcDNA克隆的筛选和测序（简报）

北京鸭ApoAI基因结构及与人和易患AS动物Ap0AI基因结构之异同目前尚不清楚，本研究利用富含鸭ApoAImRNA的肝组织，构建鸭肝组织cDNA文库，并从该文库中筛选、测出鸭ApoAIcDNA克隆序列。取健康成年雄性北京鸭2g肝组织，液氮冷冻后，按一步法快速提取鸭肝细胞总RNA，再经olig。（dt）一纤维素柱层析，分离出肝细胞mRNA。以4pgmRNA为模板，采用Pharmacia的TimeSaverSynthesisKit合成。DNA的一镇、二链。经对合成产物进行酚抽提并过SepharoseCL-4B凝胶层析柱后，将双链cDNA朱端与4pl含ECORI／N0tl酶切点的连接子连接。甲…     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

大鼠大脑皮层cDNA文库的构建

0　引言　 c DNA文库的构建和分析是分子生物学的基本方法之一 ,广泛应用于目的 c DNA的筛选 .为了筛选神经系统特异表达的基因 ,我们构建了大鼠大脑皮层的 c DNA文库 .1　材料和方法1 .1　材料　总 RNA分离 kit,m RNA分离 kit,c DNA合成kit,L ambda DNA包装 kit,L ambda gtll载体、质粒 p GEM- 7zf(+) ,DNA L adder购自 Prom ega公司 .[α- 32 P]d CTP(1 .1 1×1 0 5 GBq·m mol- 1 ,370 MBq·m L- 1 )购自北京亚辉生物工程公司 .1 .2　方法1 .2 .1　 c DNA第 1链和第 2链的合成和分析　取成年雄性SD大鼠 (2 0 0 g)大脑…     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的构建高凝状态(prothrombotic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向清减cDNA文库．方法用高淀粉饲料喂养制备大鼠PTS模型,从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A^ mRNA,分别以1．5 μg poly A^ mRNA起始,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成平均大小为400-600 bp的片段。以PTS大鼠cDNA作为Driver,对照大鼠cDNA为Tester。将Tester分为两组,分别连上不同的接头,与Driver进行两次消减杂交和两次抑制性PCR。将第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上,然后转化细菌,转化后的细菌接种于含50 μg／ml ampicillin、IPTG、和X-gal的LB琼脂平板上,将克隆计数。结果获得的克隆78％为白色克隆,成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库．结论以1．5 μg poly A^ mRNA起始,采用抑制性清减杂交,构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

人胎肝胞溶质治疗重型病毒性肝炎疗效初步观察

本文报道应用人胎肝胞溶质(h-cytosol)及综合疗法治疗20例重肝为治疗组,同期仅用综合疗法治疗的20例重肝为对照组。治疗结果表明:h-cytosol治疗重肝,不仅提高存活率(70％)(对照组仅20％),而且可减少3种及3种以上并发症病例的发生和减轻并发症的严重程度,使有并发症患者的存活率提高(53.8％)(对照组仅6.3％)。h-cytosol的制作虽比人胎肝细胞悬液复杂,但制剂性能稳定,置-20℃冰箱内可保存8个月,肌注无副反应,克服了人眙肝细胞悬液应用中存在的问题。     

高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建

目的：构建高脂血症敏感兔肝组织表达基因的抑制差减cDNA文库。方法：分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA,合成双链cDNA,酶切后将敏感组cDNA分成两组,分别与不同的接头连接,再通过再轮差杂交和两次抑制PCR得到两者之间差异表达的cDNA,将PCR产物与T／A载体连接构建差减cDNA文库,挑取克隆进行PCR扩增鉴定,结果：建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中463个有插入片段,大小范围在250－700bp之间。结论：用抑制性差减杂交及T／A克隆技术成功构建了高脂血症敏感免疫差异表达基因差减cDNA文库。     

人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体（噬菌体T7 Select10-3b）连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300～1 500 bp之间。结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术（SEREX技术）鉴定食管癌相关抗原奠定基础。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的初筛

且的对本室构建的高凝状态(PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库进行初步筛选。方法用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与GenBank DNA数据库(non—redundant,and non—mouse and non—human EST entries)中的DNA序列进行同源性分析。结果差异筛选获得5个阳性克隆,序列测定及同源性分析表明,其中2个克隆很可能是GenBank DNA数据库中尚没有的新基因或DNA序列,另外3个克隆很可能代表GenBank DNA数据库中已有的基因或DNA序列。结论大鼠肝脏5个PTS相关基因序列、尤其是其中2个GenBank中尚没有的新基因或新DNA序列的发现,为深入探讨PTS发生的分子机制及肝脏在PTS发生中的作用打下了坚实的基础。     

人类白细胞介素2表达型基因重组子pRET—90的构建

应用基因重组技术,将人类白细胞介素2(IL-2)cDNA的440bp限制性内切酶片段(HgiAI-DraI)重组于T_7 promotor质粒pET 3d的Ncol克隆点,构建成表达型重组质粒pRET-90。