水中携带非接合性质粒CTX-M型产ESBL大肠埃希菌耐药基因捕获与转移研究

目的初步探索长江水系重庆段地表水中携带非接合性质粒CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBL)大肠埃希菌(Escherichia coli,E.Coli)捕获氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside modifying enzyme,AME)编码基因及水平转移β-内酰胺酶编码基因(bla)规律,为预防与控制产ESBL大肠埃希菌危害提供理论依据。方法采用滤膜法分离、梅里埃微生物分析系统鉴定菌株;将从长江水系重庆段地表水分离出的大肠埃希菌中筛选出2株供体菌与受体菌进行接合,形成转移接合子,再次将该转移接合子与E.Coli NK5449进行接合,观察AME编码基因和bla CTX基因转移情况;用纸片扩散法测定相关菌株耐药谱;用PCR方法检测分析供、受体菌与转移接合子bla基因型、AME编码基因及整合子携带情况,并用随机扩增多态性分析技术判断相关菌株与质粒同源性。结果携带非接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌可作为受体菌与携带AME编码基因的非产ESBL供体菌接合,接合频率分别为1.6×10-6和7.2×10-6。借助外来可移动基因元件,其本身又可转变为供体菌,将bla CTX基因向其他受体菌水平转移,接合频率分别为3.7×10-6和7.4×10-6。结论与携带接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌相比,携有非接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌缺失bla CTX基因转移能力是暂时的,当有外来接合质粒、整合子或其他可移动基因元件协同作用时,该类菌株可实现耐药基因的捕获与转移,在扩大自身耐药谱同时,也可将自身blaCTX基因以较高的频率传递给其他菌株,这将促进水环境中耐药基因的扩散,增加对人类健康的威胁。     

上海地区碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌的分子生物学特性研究

【目的】分析上海市腹泻患者肠道碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的耐药特征和分子分型,为该耐药菌的监测及防控提供依据。【方法】收集上海市腹泻病监测系统23家哨点医院2018年1月—2019年12月肠道门诊患者的粪便或肛拭子样本800份,采用含1μg/μL美罗培南的麦康凯琼脂培养基分离CRE菌株。使用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定系统和VITEK MS质谱系统进行菌种鉴定。采用微量肉汤稀释法检测菌株的最小抑菌浓度(MIC)。采用多位点序列分型(MLST)及脉冲场凝胶电泳(PFGE)对耐药菌株进行同源性分析。通过接合实验研究耐药基因的可转移性。采用全基因组测序进行耐药分子特征研究。【结果】从800份粪便或肛拭子标本中分离出7株CRE菌株,皆为产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)的多重耐药大肠埃希菌,对多种临床常用的抗生素均耐药。分子分型结果显示,CRE菌株序列型别均不相同,PFGE呈现多样性。bla_(NDM)基因均为阳性,包括bla_(NDM-5)和bla_(NDM-13),主要型别为blaNDM-5,并可通过接合转移至大肠埃希菌EC600。【结论】肠道分离碳青霉烯耐药菌株均为多重耐药大肠埃希菌,其耐药机制均为产NDM,同时携带bla_(NDM)及其他多种耐药基因。MLST显示菌株属于不同的克隆型。耐药基因可通过接合转移实现耐药基因的水平转移。     

用于耐药基因体内转移研究的双荧光标记供体菌的构建

目的构建红色荧光基因标记基因组、绿色荧光基因标记RK2质粒的双荧光标记供体菌,以实现对耐药质粒在动物体内接合转移的可视化观察。方法利用RED重组技术,以Td-Tomato基因作为表达红色荧光蛋白(RFP)的基因,将Td-Tomato基因插入asl基因中间,并敲入到大肠杆菌K12基因组中制备成K12Td-tomato细菌。同时构建带有EGFP基因标记的RK2质粒EGFP-RK2,并电转K12Td-tomato细菌感受态细胞,实现双荧光标记供体菌的构建。结果构建的K12Tdtomato:RK2 (EGFP)供体菌能够稳定的同时发出绿色和红色荧光,并且荧光的表达是自发的,不需要底物的诱导。结论利用基因组技术可以构建双荧光标记的供体菌,为对耐药基因在生物体内的转移扩散研究提供了可行性。     

空气中颗粒物对耐药基因接合转移的影响

目的 研究空气中颗粒物对耐药基因体外接合转移的影响.方法 供体菌为大肠埃希菌(携带RP4质粒),受体菌为具有美罗培南抗性的肺炎克雷伯菌,在不同粒径、不同浓度颗粒物作用条件下,接合一段时间后,利用含有不同抗生素的LB琼脂固体培养基平板计数,计算接合子数量和接合转移频率.结果 PM0.1、PM2.5、PM10、1648a都...     

多重耐药质粒RP4在膜生物反应器中的水平转移

目的研究多重耐药质粒RP4在膜生物反应器(MBR)中水平转移情况,进而预测MBR处理含有耐药基因污水的生态风险。方法向正常运行的MBR中接种E.coli K12(RP4)Rif,利用含有不同抗生素的营养琼脂培养基选择性平板计数,得出可培养接合子数量和接合转移率;并利用实时定量PCR方法检测污泥中耐药质粒RP4;同时监测MBR对NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价MBR运行效能。结果接种供体菌后,可培养接合子数量、转移频率由0逐渐升高,接种供体菌后第9 d,接合子数量增加到3.38×104cfu/ml、接合转移率达1.70×10-3/cell;随后,可培养接合子数量、接合转移率都呈现波动下降(于第23天分别下降至2.55×102cfu/ml、3.20×10-5/cell);与实时定量PCR检测结果基本一致。供体菌的引入对MBR去除NH4+-N、CODCr的效率都有一定影响,即先降低后逐渐升高,污泥浓度由2200 mg/L逐渐降低至约1100 mg/L。结论实验过程中,RP4质粒在反应器中发生了较高频率的接合转移,并对反应器NH4+-N、CODCr的去除效率都产生影响。     

HORIZONTAL TRANSFER OF ANTIBIOTIC-MULTIRESISTANT PLASMID RP4 IN MEMBRANE BIO-REACTOR

目的 研究多重耐药质粒RP4在膜生物反应器(MBR)中水平转移情况,进而预测MBR处理含有耐药基因污水的生态风险.方法 向正常运行的MBR中接种E.coli K12(RP4)Rif,利用含有不同抗生素的营养琼脂培养基选择性平板计数,得出可培养接合子数量和接合转移率;并利用实时定量PCR方法检测污泥中耐药质粒RP4;同时监测MBR对NH4+ -N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价MBR运行效能.结果 接种供体菌后,可培养接合子数量、转移频率由0逐渐升高,接种供体菌后第9d,接合子数量增加到3.38×104 cfu/ml、接合转移率达1.70×10-3/cell;随后,可培养接合子数量、接合转移率都呈现波动下降(于第23天分别下降至2.55×102 cfu/ml、3.20 × 10-5/cell);与实时定量PCR检测结果基本一致.供体菌的引入对MBR去除NH4+ -N、CODCr的效率都有一定影响,即先降低后逐渐升高,污泥浓度由2200 mg/L逐渐降低至约1100 mg/L.结论 实验过程中,RP4质粒在反应器中发生了较高频率的接合转移,并对反应器NH4+ -N、CODCr的去除效率都产生影响.     

石墨烯对大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响和机制探索研究

目的 探讨石墨烯对多重耐药基因水平接合转移的影响.方法 供体菌为具有耐卡那霉素、四环素、氨苄青霉素的大肠埃希菌,受体菌为具有耐美罗培南的肺炎克雷伯杆菌,保持供、受体菌液浓度比例为1:1,配制10 ml作用体系,在37℃电热恒温箱中接合,利用含有多种抗生素的LB琼脂培养基选择平板计接合子数量并计算接合转移频率.探讨不同菌...     

非O1群霍乱弧菌耐药性及其质粒接合转移

我们对从本省腹泻病人粪便中分离的38株非01群霍乱弧菌,进行了药物敏感性测定,并对耐药菌株进行R质粒接合转移试验。药敏试验采用琼脂扩散法,并作双平皿平行对照。所用药敏纸片由上海市卫生局服务公司生化试剂厂生产,有效期内使用。质粒接合转移的主要步骤为:①供体菌(非01群霍乱弧菌耐药株)、受体菌(大肠     

健康人大肠埃希菌中Ⅰ类整合酶基因IntI1定位分析

目的:了解健康人大肠埃希菌中I类整合子基因定位情况,探讨其在细菌耐药性获得与传递中的作用.方法:采用质粒接合实验和斑点杂交实验.结果:64.3%的整合子位于接合性质粒上,35.7%位于染色体或其他非接合性质粒中.结论:本文研究的整合子阳性菌株对耐药基因的捕获主要是通过接合性质粒介导的,造成耐药基因的水平播敞.     

亚抑菌浓度抗生素对海水浴场来源肺炎克雷伯菌的接合及intI突变影响

目的探讨不同水环境介质及亚抑菌浓度抗生素对肺炎克雷伯菌的生长、耐药表型及抗性基因转移的影响。方法对海水浴场来源的肺炎克雷伯菌进行不同亚抑菌浓度的氧氟沙星、头孢他啶抗生素传代培养、运用DNAstar分析I类整合子(IntI)突变类型及突变位点,以耐药菌为供体菌,EC600为受体菌进行耐青霉素、氧氟沙星的质粒接合实验。结果经亚抑菌浓度抗生素研究发现2种抗生素亚抑菌浓度海水与生理盐水传代培养下的细菌生物量均有明显差异。但头孢他啶亚抑菌浓度下,海水介质比生理盐水介质的影响大。传代培养240 h后,细菌耐药能力增强。亚抑菌浓度抗生素作用下耐药菌的IntI突变类型主要集中于氨基酸的缺失与插入,突变位点集中在262～273。此外,4株耐青霉素耐药基因肺炎克雷伯菌成功接合,接合效率分别是2.6×10~(-6)、4.2×10~(-6)、6.0×10~(-6)、3.6×10~(-6),1株氧氟沙星1/16mic亚抑菌浓度刺激下的肺炎克雷伯菌成功接合,接合效率是6.4×10~(-6)。结论亚抑菌浓度抗生素对肺炎克雷伯菌传代培养存在差异,有诱导自发性突变的可能;证明了耐药基因可伴随接合型质粒转移。     

纳米氧化铝促进多重耐药质粒RP4接合转移机制的初步研究

目的 探讨纳米氧化铝(Al<,2>O<,3>)对细菌抗氧化系统和接合基因转录活性的影响,阐明纳米Al<,2>O<,3>促进多重耐药质粒RP4接合转移的机制.方法 接合供体菌为E.coli HB101(RP4),受体菌为沙门菌50312(Salmonella aberdeenKauffmann 50312 str<'R>...     

微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响

目的研究水污染控制系统中微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响,为控制耐药基因在水环境中的传播提供科学依据。方法向运行稳定的颗粒污泥序批式反应器(granular sequencing batch reactor,GSBR)中投加具有利福平抗性且携带RP4质粒的大肠杆菌K12〔E.coli K12(RP4)Rif〕,将系统中的污泥按照粒径划分为4个区间,分别用定量PCR方法对污泥中总细菌16S r DNA和耐药质粒RP4进行定量,从而得到不同粒径区间的接合转移比例;同时监测GSBR中NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价GSBR运行效能。结果投加供体菌后,系统中的供体菌所占比例在2 d内出现急剧下降,此后3~5 d,RP4所占比例一直稳定在10-7~10-6。从投加供体菌的第7天开始,粒径大于0.9 mm的微生物聚集体中无法检测出RP4;粒径范围在0.18~0.45 mm、0.46~0.9 mm的微生物聚集体中的RP4质粒在投加后的第11天消失;而粒径小于0.18 mm的絮状污泥中的RP4在投加供体菌后第19天消失。RP4在不同粒径微生物聚集体中的接合转移率明显不同,随着粒径的增大而降低。系统中投加供体菌后CODCr、NH4+-N的去除率均明显下降;污泥浓度(MLSS)从4855 mg/L降至3168 mg/L。结论实验过程中微生物聚集体的形态对耐药质粒RP4的接合转移有明显影响,粒径越大其接合转移率越低;且在投加供体菌初期,反应器NH4+-N、CODCr的去除能力下降明显,供体菌的投加也使污泥浓度的MLSS下降。     

产AmpC肺炎克雷伯菌质粒介导的多药耐药性与基因型研究

目的探讨产AmpC肺炎克雷伯菌耐药质粒介导的多药耐药性、耐药基因类型及转移方式。方法应用VITEK-2型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌,头孢西丁纸片扩散法筛选出疑产AmpC酶阳性菌株,采用接合转移试验了解肺炎克雷伯菌耐药基因转移方式,通过K-B法检测受体菌的多药耐药性,并通过酶粗提物头孢西丁三维试验和PCR测序等试验分析其耐药基因。结果 820株临床分离的肺炎克雷伯菌筛选出疑产AmpC酶阳性菌株108株,阳性率为13.17%;108株疑产AmpC菌经接合试验、AmpC酶表型确认试验获53株产AmpC接合子;经基因测序单纯AmpC酶基因阳性菌株34株,阳性率64.15%;同时携带ESBLs和AmpC基因菌株检出19株,阳性率35.85%;其均能通过接合转移方式将其质粒携带的耐药性传递至受体菌。结论质粒介导AmpC酶是肺炎克雷伯菌产生多药耐药的重要原因,产酶株对多种抗菌药物耐药,耐药基因质粒的转移可导致耐药性的传播扩散。     

肺炎克雷伯菌质粒编码的AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的表型和基因型分析

目的研究肺炎克雷伯菌质粒编码的AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的表型和基因型。方法利用3-氨基苯酚硼酸及ESBLs确认试验检测AmpC酶与ESBLs表型,接合转移试验了解质粒在细菌间的传递;通过质粒的提取、纯化,PCR反应及序列分析,研究肺炎克雷伯菌质粒携带的ampC基因和ESBLs基因类型。结果从肺炎克雷伯菌中获得1条约15 kb大小的质粒,此质粒可通过接合转移方式将耐药性传递至大肠埃希菌,以从肺炎克雷伯菌及接合转移后的接合子细菌中,提取的质粒为模板,均可扩增出DHA型ampC基因及SHV型ESBLs基因,序列分析进一步证实ampC及ESBLs基因型分别为DHA-1型及SHV-12型。结论从肺炎克雷伯菌可转移的质粒中,检测到DHA-1型ampC基因及SHV-12型ESBLs基因。     

产KPC型碳青霉烯酶细菌的耐药基因研究

目的检测乌鲁木齐市地区两所综合型大型三级甲等医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的KPC型耐药基因,分析耐碳青霉烯类的耐药机制。方法收集2014年8月-2015年5月45株对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的肠杆菌科细菌;通过全自动细菌鉴定分析仪VITEK-2和MS筛选出耐亚胺培南或美罗培南或亚胺培南美罗培南同时耐药的肠杆菌科细菌,采用改良Hodge试验和聚合酶链反应(PCR)扩增检测细菌产KPC型碳青霉烯酶,对KPC酶阳性的菌株做质粒转移接合试验,并将质粒转移接合成功的菌株进行测序,分析其基因型别。结果针对碳青霉烯类抗菌药物耐药的45株菌,用改良的Hodge试验23株阳性,有26株经PCR基因扩增后的产物经DNA基因测序后,比对结果为KPC-2型碳青霉烯酶,质粒转移接合试验有9株转移成功;测序结果均为KPC-2型碳青霉烯酶。结论乌鲁木齐两所综合型医院耐碳青霉烯类的抗菌药物肠杆菌科细菌耐药机制主要携带KPC-2型碳青霉烯酶耐药基因,临床与实验室应给予重视。     

克雷伯氏菌β—内酰胺酶的测定及其与耐药质粒的关系

通过对克雷伯氏菌β－内酰胺酶的测定，细菌转化及质粒接合转移等实验，发现大多数菌株的β－内酰胺酶是由质粒所编码的，少部分菌株的产生可能与细菌染色体ＤＮＡ编码有关。耐药质粒可通过接合转移方式转移至其他细菌，这在多重耐药克雷伯氏菌暴发流行中具有重要意义。     

大肠埃希菌质粒介导的bla_(NDM-1)基因耐药及传播性研究

目的探讨某院携带bla_(NDM-1)基因大肠埃希菌的流行现况及传播机制。方法收集2016年1—12月南昌大学某附属医院对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌92株,对其进行bla_(NDM-1)基因筛查,并对bla_(NDM-1)基因阳性的大肠埃希菌进行其他常见碳青霉烯酶基因检测。将bla_(NDM-1)基因阳性的大肠埃希菌(供体菌)与大肠埃希菌J53(受体菌)进行接合试验,采用药敏试验及mCIM试验对接合子进行表型验证,提取供体菌及接合子的质粒采用Southern blot技术对bla_(NDM-1)基因进行基因定位,并验证其水平转移的能力。结果在对碳青霉类抗生素不敏感的92株大肠埃希菌中发现2株携带bla_(NDM-1)基因,携带率2.2%。此2株大肠埃希菌未发现同时携带其他常见碳青霉烯酶基因。接合试验及Southern blot发现此2株大肠埃希菌的bla_(NDM-1)基因均位于菌株的质粒上,且有1株大肠埃希菌的bla_(NDM-1)基因可以通过质粒向大肠埃希菌J53转移。药敏试验结果显示,此2株大肠埃希菌对临床使用的多种抗菌药物耐药,且接合子获得了与供体菌相似的药敏结果。mCIM试验表明,此2株大肠埃希菌及接合子均产NDM-1型碳青霉烯酶。结论该院存在携带bla_(NDM-1)基因而产NDM-1型碳青霉烯酶的大肠埃希菌,携带bla_(NDM-1)基因的大肠埃希菌对临床使用的大多数抗菌药物耐药,质粒可介导bla_(NDM-1)基因的水平传播。     

医院感染革兰阴性杆菌中整合子介导耐药及水平播散机制研究

目的 研究整合子在医院感染革兰阴性杆菌中的分布及其与病原菌耐药的相关性,探讨Ⅰ类整合子与临床耐药播散的关系.方法 运用K-B法检测临床株的耐药表型,纸片扩散法检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),PCR扩增筛选含整合子的临床菌株,接合传递实验、套式PCR、质粒谱分析及DNA测序研究携带耐药基因的Ⅰ类整合子与耐药播散的关系.结果 66.4%的医院感染革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子阳性,未检测出Ⅱ、Ⅲ类整合子;Ⅰ类整合子可变区扩增片段大小从0.7～2.3 kb,编码对氨基糖苷类、磺胺类抗菌药物和氯霉素耐药的基因;整合子阳性组中ESBLs、多药耐药菌均明显高于阴性组;整合子可通过质粒在不同菌属闻水平传播.结论 Ⅰ类整合子在医院感染革兰阴性杆菌中广泛分布,可通过质粒在不同菌属间水平传播,在耐药基因传播中起重要作用,应引起临床足够的重视.     

南通地区食源性沙门菌多重耐药性与整合子的相关性研究

目的通过对南通地区食源性沙门菌整合子的检测及耐药性分析,初步探讨整合子、基因盒与耐药性的相关性。方法采用纸片扩散法(kirby-bauer)对67株食源性沙门菌进行耐药性分析,从中选取多重耐药性菌株,提取纯化不同菌株共有的质粒,应用PCR法扩增整合子并进行分类;随机选取1例PCR产物进行DNA测序。结果 67株南通地区食源性沙门菌中31.3%具有多重耐药性;Ⅰ类整合子阳性14株,未发现Ⅱ类、Ⅲ类整合子;10株沙门菌携带质粒,质粒数目为1个~3个,大小为0.5 kb~4 kb;Gen Bank数据库BLAST软件分析1例PCR产物(1.5 kb片段)含有3个开放阅读框,分别与dfr A1、sat2和aad A1耐药基因盒对应。结论南通地区食源性沙门菌对氨苄西林、环丙沙星和哌拉西林等药物出现较高的耐药性;耐药基因可由Ⅰ类整合子携带,并可通过接合试验发生转移,这对细菌多重耐药性的产生和传播转移起到非常重要的作用。     

大肠埃希菌获得性耐药基因检测及指标聚类分析

目的 调查大肠埃希菌45种获得性耐药基因和7种可移动遗传元件遗传标记基因的存在状况,以及获得性耐药基因和可移动遗传元件遗传标记基因的相关性.方法 收集南京医科大学第一附属医院2006年3月-2008年10月患者尿液标本中分离的大肠埃希萄共60株,采用聚合酶链反应(PCR)法分析45种β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类获得性耐药基因和7种整合子、转座子、插入序列、接合性质粒遗传标记基因,并用指标聚类分析(SPSS法),分析β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类获得性耐药基因与整合子、转座子、插入序列、接合性质粒遗传标记基因的相关性.结果 60株大肠埃希菌共检测到10种获得性耐药基因(包括3种β-酰胺类获得性耐药基因、6种氨基糖苷类获得性耐药基因、1种喹诺酮类获得性耐药基因);且7种可移动遗传元件遗传标记基因均有检出,包括1种整合子基因遗传标记基因、4种转座子和插入序列基因遗传标记基因、两种接合性质粒遗传标记基因,其余35种基因均未检测到;SPSS法将上述阳性检出基因分成A和B两大簇群.结论 大肠埃希菌对抗菌药物的耐药表型与获得性耐药基因相关,且可移动遗传元件的水平转移使细菌的耐药性在同种细菌菌株之间甚至不同种细菌菌株之间得以快速传播;获得性耐药基因与可移动遗传元件遗传标记基因的指标聚类分析显示,在A簇群中,aadA5与intⅠ 1、CTX-M-55与ISEcp1、TEM-1与IS26较为相关,并有可能位于携带traA、trbC性毛基因的接合性质粒上,在B簇群中,aac(6')-Ⅰb与Tn21较为相关.