光果甘草GgUGE基因的克隆和序列分析

目的:通过克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase,UGE)基因并进行生物信息学分析,探究光果甘草UGE基因与甘草酸生物合成分子调控之间的潜在关系。方法:从光果甘草主根中提取RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆得到UGE基因c DNA序列,测序并进行序列分析。结果:成功克隆得到一条长度为1 121 bp的光果甘草UGE基因(Gg UGE) c DNA序列,包含1个长度为1 053 bp的开放阅读框(ORF),共编码350个氨基酸残基,在Gen Bank上对所得c DNA序列进行注册,序列注册号为MK638908。序列分析表明Gg UGE基因编码蛋白为不稳定亲水蛋白,理论相对分子质量为39. 02 k Da,等电点为6. 13,不含信号肽,无跨膜区,二级结构以α-螺旋为主,保守结构域含有葡萄糖4-差向异构酶基因家族结构域。Gg UGE基因的c DNA序列和氨基酸序列聚类分析结果表明其与豆科植物亲缘关系最近,而与杨柳科植物亲缘关系较远。结论:首次克隆得到了光果甘草Gg UGE c DNA序列,对其进行了生物信息学分析,为后续Gg UGE基因的功能研究以及甘草酸生物合成分子调控机制的解析提供参考。     

光果甘草CHS基因的克隆与多态性分析

目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS c DNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析。结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS c DNA序列,测序结果显示其一致性99.10%,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条c DNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34%,存在25个变异位点。生物信息学分析表明光果甘草CHS c DNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 k Da,等电点5.75~6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。同源性分析显示,光果甘草CHS c DNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上最近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上最远。结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS c DNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性。     

甘草UGDH1基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的 对甘草尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UGDH）基因进行克隆、生物信息学及表达分析。方法 提取6周龄乌拉尔甘草幼苗根、茎、叶的总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）克隆GuUGDH1基因（Gu表示甘草）互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,测序并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术进行组织特异性分析。结果 克隆所得GuUGDH1基因的开放阅读框（ORF）全长1 443 bp,编码480个氨基酸残基（GenBank登录号MT968993）;生物信息学分析显示,GuUGDH1属于稳定的酸性亲水蛋白,相对分子质量53.056 kDa,等电点5.89,不含信号肽,不含跨膜螺旋且都在膜外;含有3个典型的保守结构域,属于尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖/鸟苷二磷酸（GDP）-甘露糖脱氢酶家族;系统进化分析表明,GuUGDH1基因与豆科植物大豆Glycine max,密花豆Spatholobus suberectus的亲缘关系较近;Real-time PCR检测结果表明,在6周龄甘草幼苗的根、茎、叶中都能检测到GuUGDH1基因的表达,根的表达量显著高于茎和叶。结论 本研究克隆得到了甘草UGDH1基因并对其蛋白序列特征进行了系统分析,可为进一步研究UGDH1蛋白的催化功能提供理论依据。     

HPLC测定光果甘草中光甘草定的含量

目的：采用HPLC测定光果甘草粗黄酮浓缩物中光甘草定的含量。方法：以FL2200-II为高效液相色谱仪,采用UltimateXB—C。8色谱柱,以水和乙腈为流动相,进行梯度洗脱,检测波长280nm,流速1．0mL·rain-1。结果：光甘草定在9．5～475txg·mL。内线性良好,r=0．9998;测得某光果甘草粗黄酮浓缩物中光甘草定的平均含量为3．58％,RSD=1．23％,平均加标回收率99．04％,RSD=0．26％。结论：利用反相高效液相色谱对甘草粗黄酮浓缩物中的光甘草定进行含量测定,方法简便,准确度高,重现性好,可应用于光甘草定的含量测定。     

光果甘草的研究进展

光果甘草的主要化学成分为三萜皂苷和黄酮类化合物,具有调血脂、抗氧化、抗炎和抑制酪氨酸酶活性等药理作用。在临床应用中,光果甘草中的甘草皂苷成分在镇咳祛痰、清热解毒、治疗溃疡和急慢性病毒性肝炎等方面都具有显著效果。光果甘草在医疗和日用化工行业具有广阔的发展前景。就近年来国内外对光果甘草的化学成分、药理作用和临床应用的研究进展作了综述,为光果甘草的进一步开发利用提供科学依据。     

新疆地区光果甘草与胀果甘草化学成分差异的多元统计分析

目的 采用多元统计分析,比较研究胀果甘草和光果甘草化学成分的差异,为甘草质量评价提供参考。方法 从新疆喀什、图木舒克、阿克苏及和田等地区分别收集胀果甘草和光果甘草各10批样品,依据课题组已建立的高效液相色谱法（HPLC）测定胀果甘草和光果甘草中20个化学成分（2个三萜皂苷类、2个香豆素类、3个查耳酮类、13个黄酮类化合物）含量,通过t检验、聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）评价胀果甘草和光果甘草的化学成分差异。结果 新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G₂及异甘草素是胀果甘草和光果甘草的差异化学成分。结论 不同结构类型的化学成分在胀果甘草和光果甘草中含量均存在一定差异,为甘草药材的质量控制和标准制定提供参考。     

甘草microRNA及其靶基因的生物信息学预测

目的利用生物信息学手段预测甘草Glycyrrhiza uralensis的micro RNA(mi RNA),并实验验证其存在,确定相应的靶基因,为理解甘草mi RNA的生物学功能奠定基础。方法下载公共核酸数据库中的甘草高通量测序序列和表达序列、标签序列,使用Trinity和Assembler等软件拼接以获得转录本数据。基于mi RNA前体序列在植物物种间的保守性,将mi RBase数据库中的已知植物mi RNA前体与甘草转录组序列进行Blast比对,按照mi RNA前体应具备的标准进行筛选。通过stem-loop q RT-PCR实验验证mi RNA。使用ps RNATarget软件进行mi RNA的靶基因预测,并对靶基因进行功能分析。结果序列拼接获得88 263条甘草转录组数据。使用这些数据预测到分属于17个家族的49个mi RNA序列,以及相应的30个茎环结构前体,随机选取其中12个,经实验验证,确实存在。这些mi RNA靶向的172个基因主要参与基因转录调控、信号转导、发育调控和防御反应等生物学过程。结论新预测的甘草mi RNA及其靶基因为进一步研究mi RNA在甘草中的生物学功能奠定了基础。     

滇龙胆环烯醚萜氧化酶基因及启动子的克隆与生物信息学分析

目的从滇龙胆叶片中克隆单萜合成关键酶环烯醚萜氧化酶(GrIDO)基因及其启动子序列,并进行序列分析。方法根据滇龙胆转录组GrIDO基因序列设计基因特异性引物,使用RT-PCR方法克隆GrIDO基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,基于在线软件对GrIDO基因序列进行生物信息学分析。同时,根据GrIDO基因ORF序列,设计特异性引物,采用PCR法对该基因启动子序列进行扩增,并进行序列分析。结果 GrIDO基因(GenBank登录号KP722034)ORF全长1 557 bp,编码518个氨基酸;GrIDO蛋白相对分子质量58 920,理论等电点8.40,属于细胞色素P450超家族成员,可能定位于叶绿体;无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(51.07%)和环(42.69%)构成;GrIDO蛋白与长春花CrIDO蛋白具有较高的相似性(85.83%),且亲缘关系较近。GrIDO基因启动子(GenBank登录号KT428570)长720 bp,具有TATA-box和CAAT-box,还具有参与脱落酸和茉莉酸甲酯应答的顺式作用元件、光应答元件和MYB结合位点。结论GrIDO基因表达受多种因素调控。克隆了GrIDO基因ORF及其启动子,为GrIDO基因的功能验证奠定基础。     

新疆光果甘草黄酮类成分的抗氧化活性

 目的从新疆光果甘草中制备总黄酮(LGFs)及单体成分光甘草定(glabridin,GLB),并研究它们的抗氧化活性。方法用常规方法制备LGFs和GLB;利用HL-60细胞中的Myeloperoxidase/H₂O₂/HClO氧化系统和肝微粒体中的细胞色素P450/NADPH氧化系统做体外抗氧化实验模型,对LGFs和GLB的抗氧化活性进行测定。系统中自由基诱发程度由探针物DCFH-DA的氧化产物DCF的浓度来检测。银杏叶提取物EGb761用作阳性对照物。结果在两种体外模型中,LGFs和GLB均显示较强的抗氧化活性,它们清除自由基活性强度为EGb761≥GLB>LFs。结论甘草总黄酮及其中的主要活性成分GLB在HL-60细胞和肝微粒体氧化系统中具有很强的抗氧化活性。这些结果可部分解释甘草药理作用与其抗氧化预防活性的关系。     

铁棍山药SUS基因CDS区克隆与生物信息学分析

目的:对铁棍山药蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)基因的编码区域(coding sequence,CDS)进行克隆和蛋白质结构分析,为该基因的调控机制与山药多糖的合成机制提供理论依据。方法:提取铁棍山药总RNA并反转录为cDNA第一链,根据本实验室铁棍山药基因组数据经注释得到的SUS基因序列设计一对特异性引物,利用基因克隆技术获得SUS基因的编码区域并通过蛋白质预测分析软件分析蛋白质序列特征。结果:克隆得到一个长度2 448 bp的基因序列,具有一个完整的开放阅读框架(open reading frame,ORF),命名为DoSUS1。DoSUS1的分子式为C_(4209)H_(6534)N_(1115)O_(1205)S_(23),相对分子质量9 788.32,共815个氨基酸,理论等电点(PI)6.10,消光系数为110 505,脂溶性指数(AI)为94.15,不稳定指数为32.18,平均亲水指数(GRAVY)为-0.225,属于稳定可溶性酸性蛋白质。DoSUS1氨基酸序列存在多个磷酸化位点,不存在跨膜区与信号肽。蛋白质二级结构与三级结构结果显示DoSUS1属于全α类蛋白质。功能域预测结果显示DoSUS1有蔗糖合成与糖基转移两个功能域。同源性比对结果显示DoSUS1的氨基酸序列与所比对单子叶植物的氨基酸序列相似性均80%。系统进化树显示DoSUS1与单子叶植物的SUS进化关系较近。结论:首次从铁棍山药中克隆出SUS基因的编码序列,并对其蛋白质结构进行了分析,为进一步阐明SUS在山药生长发育和多糖合成机制中的作用奠定了基础。     

光果甘草根中黄酮类化学成分研究

目的研究光果甘草Glycyrrhiza glabra根中的化学成分。方法利用硅胶柱色谱及半制备HPLC进行分离纯化,通过理化性质及现代波谱技术对分离得到的化合物进行结构鉴定。结果从光果甘草醋酸乙酯部位分离得到10个异黄烷类化合物,分别鉴定为光甘草素T(1)、光甘草定(2)、glyasperin C(3)、甘草西定(4)、异甘草黄酮醇(5)、甘草异黄酮A(6)、甘草异黄酮B(7)、半甘草异黄酮B(8)、芒柄花素(9)、甘草素(10)。结论化合物1为新的异黄烷类化合物,化合物3～6为首次从该植物中分离得到。     

大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C_(1011)H_(1547)N_(233)O_(257)S_(10),理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。     

甘草总皂苷及水提物对肝损伤大鼠肠道菌群的影响

目的探讨甘草总皂苷及水提物对肝损伤大鼠肠道菌群的影响。方法采用ip四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型,模型大鼠分为4组,分别ig给予甘草总皂苷和甘草水提物,并以联苯双酯作为阳性对照组,模型组ig生理盐水。同时设对照组,ig给予生理盐水。于给药结束后,测定各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平;收集大鼠粪便,通过16 S rRNA测序对各组大鼠肠道菌群的多样性进行分析。结果与对照组比较,模型组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高(P<0.05、0.01);与模型组比较,各给药组大鼠血清中ALT、AST水平均显著降低(P<0.05、0.01);与模型组比较,联苯双酯组大鼠菌群结构未发生显著变化,而甘草总皂苷组及甘草水提物组均表现出不同的群落组成。并且相对于水提物组,总皂苷组显著提高了乳酸杆菌属和杆菌门S24-7科菌群的相对丰度。但甘草总皂苷组和甘草水提物组的大鼠肠道菌群与对照组大鼠肠道菌群之间仍存在差异,并没有完全恢复到正常状态。结论甘草总皂苷与甘草水提物均可以改善慢性肝损伤,并对肝损伤大鼠肠道菌群发挥不同的调控作用。     

多年生乌拉尔甘草复合丛枝菌根真菌接种效应研究

目的：探究2种丛枝菌根真菌复合与独立接种对田间栽培多年生乌拉尔甘草生长与有效成分积累的长短期效应。方法：选取摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae与根内根孢囊霉Rhiaophagus intraradices 2种丛枝菌根真菌菌种,在大田条件下对乌拉尔甘草进行单菌种与复合菌种接种处理,分别于栽培的第1年和第2年采集乌拉尔甘草样品,分析其形态指标和有效成分甘草酸、甘草苷含量。结果：田间试验结果表明,复合接种和摩西斗管囊霉单接种均对乌拉尔甘草中甘草酸与甘草苷含量有提升作用,其中复合接种提升效果最为显著,其次为摩西斗管囊霉单接种,根内根孢囊霉单接种处理无显著提升作用。接种处理组乌拉尔甘草种苗的生长指标与对照组差异无统计学意义。接种丛枝菌根真菌显著提高了甘草苷含量与甘草酸含量的比值,接种组甘草苷、甘草酸的积累速率呈显著正相关且与对照组有明显差异。结论：揭示了大田条件下复合丛枝菌根真菌接种的长期效应,发现摩西斗管囊霉与根内根孢囊霉复合接种可以提高大田栽培乌拉尔甘草的品质,并对甘草苷与甘草酸的含量比例有调节作用,为人工栽培乌拉尔甘草过程中丛枝菌根真菌利用提供参考。     

短时外源甘草酸刺激下的甘草次生代谢产物影响关系研究

试验拟在人工模拟的高甘草酸含量环境下,探寻甘草中次生代谢产物间的相互影响关系,筛选出与甘草酸含量明显相关的次生代谢产物.通过根部浸泡甘草酸铵溶液,分析浸泡后72 h内甘草根中4种次生代谢产物含量的变化,统计学软件分析各成分与甘草酸含量的相关性.结果表明高浓度1.0mmol· L-1甘草酸的根部浸泡对于在甘草中模拟高甘草酸含量环境是切实可行的,且在短时外源甘草酸刺激时,甘草中甘草酸和甘草苷的含量存在明显的正相关关系.外源甘草酸刺激对甘草植株体内甘草酸的合成积累产生一定的影响,且甘草酸的积累与甘草苷含量密切相关.     

乌拉尔甘草转鲨烯合成酶基因毛状根系研究

目的:为了研究甘草酸的合成调控途径及提高甘草酸合成水平.方法:将已克隆的乌拉尔甘草鲨烯合成酶基因(GuSQS1,GenBank登录号为:AM182329)通过发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4的介导,转化甘草下胚轴并诱导毛状根的形成.建立的毛状根系经0.8 mg·L~(-1)的除草剂(PPT)抗性筛选、PCR和Southern blotting检测分析后,得到的转基因毛状根系经HPLC检测甘草酸(GA)含量.结果与结论:转基因毛状根中甘草酸的最高含量约为野生型毛状根的3.6倍.     

Aqueous extracts and polysaccharides from Liquorice roots (Glycyrrhiza glabra L.) inhibit adhesion of Helicobacter pylori to human gastric mucosa

Aims

Aqueous extracts from the roots of Glycyrrhiza glabra L. (Fabaceae) are widely used for treatment of stomach ulcer. The clinical proven effects are related to the presence of anti-inflammatory 12-keto-triterpensaponins in the extracts. Apart from that the influence of Glycyrrhiza glabra extract on the bacterial adhesion of Helicobacter pylori to stomach tissue was to be investigated. Additionally the influence of Glycyrrhiza glabra secondary compounds on the bacterial adhesion of Porphyromonas gingivalis, a major pathogen for induction of periodontal inflammations was to be investigated.

Methodology

In vitro cytotoxicity against Helicobacter pylori was investigated by agar diffusion assay; antiadhesive properties of aqueous extract, raw polysaccharides and purified polysaccharide fractions was investigated by means of an in situ adhesion assay with FITC-labelled bacteria on tissue slides of human stomach resectates.

Results

Aqueous extract (1 mg/mL) of Glycyrrhiza glabra significantly inhibited the adhesion of Helicobacter pylori to human stomach tissue. This effect was related to the polysaccharides isolated from the extract, with one purified acidic fraction (0.25 SPB) as main active polymer. Purified polysaccharides did not exhibit direct cytotoxic effects against Helicobacter pylori and did not influence hemagglutination. Additionally raw polysaccharides from Glycyrrhiza glabra were shown to have strong antiadhesive effects against Porphyromonas gingivalis.

Conclusion

Aqueous extracts and polysaccharides from the roots of Glycyrrhiza glabra are strong antiadhesive systems, which may be used as potent tools for a further development of cytoprotective preparations with anti-infectious potential.