激活骨髓和淋巴因子激活的杀伤细胞生物活性的实验研究

目的 :证实激活骨髓 (Activated bone marrow,ABM)具有与淋巴因子激活的杀伤 (LAK)细胞不同的生物学效应。方法 :应用重组白细胞介素 - 2 (r IL - 2 )、抗 CD3 单抗体外激活骨髓和外周血单个核细胞 ,以 MTT比色分析法测定 ABM、L AK细胞的杀伤活性 ,采用甲基纤维素半固体培养法进行粒 -巨噬细胞系祖细胞 (CFU- GM)、红系祖细胞 (BFU- E)培养。结果 :r IL- 2 +抗 CD3 单抗激活的 ABM组杀伤活性最强 (6 5 .8± 9.2 ) % ,r IL - 2激活的 ABM组次之为 (5 6 .3± 7.9) % ,活性强于相同条件下的 L AK组 ,两组差异具有显著性 (P<0 .0 1)。增殖倍数与相同条件下的 LAK细胞相比差异亦具有显著性。体外激活 3～ 5 d的 ABM与同期培养的未激活的骨髓细胞相比 BFU- E、CFU- GM形成率差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,LAK细胞则不具有造血祖细胞活性。结论 :ABM的杀伤活性和增殖效应明显强于 L AK细胞 ,且能保持造血祖细胞活性 ,抗 CD3 单抗能够促进 r IL - 2诱导的 ABM抗肿瘤活性和增殖效应 ,不损伤造血祖细胞活性 ,是优于 LAK细胞的过继免疫疗法。     

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用。方法 分离外周血单个核细胞,应用GM－CSF及IL－4诱导DC产生,用TNF－α和PGE2促进其成熟,并用肺癌细胞系GLC－82可溶性抗原致敏。将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC－LAK）,用MTT法检测DC－LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 经GM－CSF,IL－4,TNF－α,PGE2作用后,细胞表达CD1a阳性率为71．0％,CD8350．0％,CD14阳性率低于10．0％,高表HLA－I,HLA-Ⅱ和CD45,为典型的DC表型特征。DC－LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC－82,A549,moser和MCF－7）的杀伤率,前为84．7％,66．9％,49．3％和56．0％,后为43．5％,31．3％,45．0％和32．4％。结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC。     

IL-15联合GM-CSF对外周血中NK细胞活性的影响

目的选择细胞因子IL-2、IL-15和GM CSF作为刺激物,观察其对NK细胞的激活作用。方法健康成人及化疗缓解后的白血病患者外周血细胞单个核细胞,经过IL-2、IL-15、GM CSF培养,MTT法检测其增殖程度的变化,及活化后的单个核细胞对白血病K562的细胞毒作用。结果正常人外周血单个核细胞及化疗后缓解组外周血单个核细胞,经过IL-2、IL-15、IL-15 GM CSF分别作用后,细胞均呈现不同程度的增殖。但化疗后缓解组与各组的细胞因子联合孵育后,其增殖程度均小于正常人。其杀伤活性IL-15活化组优于IL-2组,而IL-15联合应用GM CSF后对K562杀伤活性优于单用IL-15。缓解组与正常对照组相比对K562的杀伤活性均明显降低,当与细胞因子IL-15、GM CSF联合孵育后,杀伤活性均显著提高(P<0.01),并且缓解组接近正常人水平。结论正常人及白血病患者的外周血单个核细胞与IL-15和GM CSF联合孵育,有效刺激外周血单个核细胞增殖。明显提高了正常人及白血病患者的外周血单个核细胞对K562的杀伤能力。     

抗原致敏DC联合LAK细胞对肺腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察抗原致敏树突状细胞（DC）联合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞对肺腺癌细胞的杀伤作用。方法：采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC）,常规诱导出DC、LAK细胞。倒置显微镜观察细胞的形态和增殖情况;应用流式细胞仪（FCM）测定细胞表型上变化鉴定这两种细胞。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化;利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测法把DC-LAK细胞和DC-LAK-A549细胞作为效应细胞,肺腺癌A549细胞作为靶细胞,进行杀伤试验。结果：①体外诱导单个核细胞培养出DC和LAK细胞。②共培养后DC-LAK细胞的免疫表型表达增加。抗原致敏DC联合LAK细胞（DC-A549-LAK）组的免疫表型表达与对照组相比更有显著性意义。③共培养细胞在增殖倍率上有显著意义。④MTT显示共培养后的LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。结论：从外周血单个核细胞中诱导出具有典型形态和免疫表型的DC和LAK细胞。DC和LAK细胞共培养细胞,增殖活性、免疫表型、杀伤活性方面高于单纯培养的LAK细胞。抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。     

四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的比较

目的：比较四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用。方法：选用脐带血制备LAK细胞，并与临床常用的外周血、胎脾及胸腺LAK细胞在体外扩增及抗肿瘤作用方面比较。结果：脐带血的扩增能力显著高于其余3种LAK细胞（P＜0．01），每份脐带血LAK细胞总数可增殖至2．5×1010；抗肿瘤活性以脐带血LAK对SMMC-7221肝癌细胞出现最早（第3d）、活性最强（85％±3％），明显强于其余三者（P＜o．01）；对K562的杀伤作用仍属脐带血LAK最强；而胸腺LAK的活性最弱。结论：脐带血LAK细胞体外增殖快，杀伤活性强，可用于肿瘤的过继性免疫治疗。     

B7基因转染联合LAK细胞治疗肝癌的体外研究

目的：探讨体外诱导的LAK细胞对B₇基因转染的肝癌细胞的杀伤作用。方法：构建含人B_7-1基因cDNA的真核表达载体pRCCMV-B_7-1,脂质体介导转染法将pRCCMV-B_7-1转入人肝癌细胞系SMMC7721,G418筛选转染肝癌细胞（B₇⁺SMMC7721）。RT-PCR、流式细胞仪鉴定目的基因表达。MTT比色试验体外检测LAK细胞对B_7-1转染肝癌细胞的杀伤活性。结果：B₇⁺SMMC7721细胞稳定表达B₇基因。LAK细胞对B₇⁺SMMC7721细胞的杀伤活性明显高于野生型SMMC7721者,结果有统计学意义。结论：B₇基因体外转染人肝癌细胞后可表达有活性的B₇分子,LAK细胞对表达B_7-1的肿瘤呈现增强的杀伤作用。     

植物血凝素及淋巴因子激活的杀伤细胞胞体外抗肿瘤作用的MTT比色法分析

目的：检测植物血凝素及淋巴因子激活的杀伤细胞（PHA－LAK）的体外广谱抗肿瘤作用。方法：用MTT比色法测定PHA－LAK对体外培养的K562，MGc80-3,143TK^-,143TK^-,HeLa,LoVo等5种肿瘤细胞的杀伤活性。结果：PHA－LAK对5种不同组织器官来源的肿瘤细胞均有明显杀伤活性，在效靶化为7．5：1．0时，PHA－LAK对143TK^-细胞的杀伤率可高达57．3％，杀伤效应随效靶比增加而升高；但在效靶比为15：1时，杀伤效应不随效靶比增加而增高数。结论：（1）来自健康献血员的PHA－LAK对肿瘤细胞具非特异性杀伤活性，能较好解决传统过继免疫治疗中免疫应细胞的数量和活性问题；（2）在一定的条件下，MTT法用于检测免疫效应细胞的杀瘤作用时才具寻敏，可靠的优点。     

负载胃癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗胃癌细胞效应

目的　研究负载胃癌酸洗抗原树突状细胞 (DC)诱导的特异性CTL对胃癌细胞的杀伤效应。方法　酸洗涤法获得SGC790 1细胞膜抗原多肽 ,GM CSF、IL 4和TNF a体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原 ,制备胃癌抗原特异性CTL ;用CytoTox 96TM检测其对SGC790 1体外杀伤效应。结果　负载胃癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对SGC790 1的杀伤率达 88 95 % ,显著高于LAK细胞的杀伤率 (P <0 0 5 )。且其对同种不同分化类型的胃癌细胞株MGC80 3、MNK2 8也有较高的杀伤效应 ,而对LOVO及HepG2肿瘤细胞株无显著杀伤作用 (P >0 0 5 )。结论　负载胃癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗胃癌效应 ,提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高胃癌综合治疗水平。     

济南假单胞菌菌苗促LAK活性的研究

研究了济南假单胞菌菌苗（PJV）在体外对小鼠脾LAK细胞活性的影响。结果表明，1．PJV对YAC－1肿瘤靶细胞在3．9－62．5μg/ml浓度范围内对单个核脾细胞有明显的刺激增殖作用，此增殖细胞对肿瘤靶无杀伤作用；2．PJV在LAK细胞的诱导阶段可增加其诱导数量和增殖活性，提高伤活性，但PJV在LAK细胞杀伤阶段对其活性无影响，3．PJV不能单独促进脾产生细胞IL－2，但可促进ConA诱导脾细胞产生的IL－2活性。     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。     

CD3AK细胞治疗恶性脑质瘤体外实验

目的：提高人脑胶质瘤过继免疫治疗的效果,探讨治疗脑胶质瘤的新途径。方法：用CD3和rIL-2共同诱导人外周血单个核细胞,诱导、扩增新型抗胶质瘤效应细胞CD3AK细胞,并与LAK细胞在某些生物学方面进行了比较。结果两组效应细胞增曲线均于第6天达高峰,峰值可见,CD3AK细胞＞LAK细胞（P＜0．05）;CD3AK细胞扩增倍数明显高于LAK细胞（P＜0．05）;两组效应细胞于培养的第6、8、10天所测得的杀伤胶质瘤细胞BT325活性可见,CD3AK细胞＞LAK细胞（P＜0．05或P＜0．01）。结论CD3和rIL-2具有协同增强作用,使CD3A细胞成为较LAK细胞增殖能力、杀伤活性更强的免疫效应细胞,且rIL-2用量减少,有胶质瘤的过继免疫治疗打下了理论基础。     

GM-CSF对膀胱癌EJ细胞株CD44v6表达的影响

目的：明确GM－CSF对EJ细胞增殖及对CD44v6表达的影响。方法：MTT法检测GM－CSF和IFN对EJ细胞增殖的影响，免疫细胞化学法观察GM－CSF对CD44v6表达的影响。结果：GM－CSF以不同浓度作用EJ细胞对其增殖无影响，但GM－CSF联用IFN可抑制J细胞增殖，GM－CSF连用IF可降低CD44v6表达。结果：GM－CSF＋IFN可降低CD44v6在EJ细胞中的表达。     

济南假单胞菌菌苗促LAK活性的研究

研究了济南假单胞菌菌苗(PJV)在体外对小鼠脾LAK细胞活性的影响。结果表明:1.PJV对YAC-1肿瘤靶细胞在3.9～62.5μg/ml浓度范围内对单个核脾细胞有明显的刺激增殖作用,此增殖细胞对肿瘤靶细胞无杀伤作用;2.PJV在LAK细胞的诱导阶段可增加其诱导数量和增殖活性,提高杀伤活性,但PJV在LAK细胞杀伤阶段对其活性无影响;3.PJV不能单独促进脾产生细胞IL-2,但可促进ConA诱导脾细胞产生的IL-2活性。     

人参茎叶皂甙对LAK细胞抗肿瘤活性的正向调节作用

体外实验,79例正常人PBL诱生的LAK细胞分别对13例新鲜急性白血病细胞和K562细胞的杀伤活性,较7例未经IL—2激活的PBL对同样靶细胞的杀伤活性明显高。适宜浓度的人参茎叶皂甙可明显增强LAK细胞抗肿瘤活性。提示人参茎叶皂甙对辅助LAK细胞联合IL—2过继输入治疗恶性肿瘤有潜在的使用价值。     

抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：观察肝癌细胞抗原致敏的树突状细胞（Dendritic cells,DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK）共培养后的细胞增殖活性、表型的变化及其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性。方法：采集健康供者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,常规诱导出DC、CIK,用肝癌细胞HepG2抗原冲击DC（Ag-DC）,并将其与CIK共培养（Ag-DC-CIK）,观察CIK和Ag-DC-CIK的细胞表型及增殖活性,并以肝癌细胞HepG2作为靶细胞,用MTT法检测CIK和Ag-DC-CIK的杀伤活性。结果：肝癌细胞抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,Ag-DC-CIK细胞群增殖活性明显增强,且高表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,其增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高（P<0.05）。结论：肿瘤抗原致敏的DC与CIK共培养获得的Ag-DC-CIK增殖活性和对肝癌细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。     

人参皂甙R_g1协同诱生LAK细胞的抗瘤活性

用51Cr释放试验检测人参皂甙Rg1协同诱生LAK细胞对K_(562)细胞的杀伤活性。9例正常人PBL诱生的LAK细胞对K_(562)细胞的杀伤活性(30.86±16.58％)高于8例NK细胞(12.18±5.47％)。5～50μg/ml人参皂甙Rg1对LAK细胞活性皆有增强作用,尤以50μg/ml人参皂甙Rg1作用明显,其协同诱生LAK细胞的活性(56.43±12.18％)高于对照组(43.18±20.32％,P<0.05)。     

唑来膦酸刺激人外周血单个核细胞体外扩增γδT细胞及其在肝癌非特异性免疫中的作用

目的探讨唑来膦酸刺激人外周血γδT细胞的增殖作用,同时测定增殖后的γδT细胞对人肝癌细胞的杀伤效能。方法以不同浓度的唑来膦酸联合IL-2刺激健康人外周血γδT细胞增殖。以流式细胞仪检测相关表型,3H-TdR掺入法测定细胞增殖程度。以γδT细胞作为效应细胞,分别以不同人肝癌细胞作为靶细胞。以SRB法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效能。结果外周血γδT细胞增殖明显,唑来膦酸为1μmol/L浓度时,γδT细胞增殖最明显。所得γδT细胞对3种肝癌细胞均表现出明显的杀伤作用。结论唑来膦酸能明显促进人外周血γδT细胞的增殖,且扩增的γδT细胞在体外对肝癌细胞有显著的杀伤作用。     

索拉菲尼联合细胞因子活化的杀伤细胞对肝癌的杀伤效应研究

目的 探讨索拉菲尼联合细胞因子活化的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)对肝癌细胞的体外杀伤效应.方法 取健康人外周血单个核细胞,经IFN-γ、IL-1、IL-2和抗CD_3单抗诱导CIK细胞成熟,流式细胞仪检测培养第1、7、14天的CIK细胞表型.Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)检测索拉菲尼、CIK细胞及两者联合对肝癌细胞BEL-7402的体外杀伤效应,并用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测肝癌细胞的凋亡率.结果 CIK细胞经多种细胞因子诱导培养后,CD_3+CD_(56)~+细胞比例明显上升,14d时CD_3~+CD_(56)~+ 细胞比例达(46.83±2.53)%,与第1天比差异有显著性(P<0.01),细胞量扩增了近1 000倍.索拉菲尼和CIK细胞在适当浓度及效靶比联合应用时表现出杀伤活性增强(P<0.01).索拉菲尼联合CIK细胞诱导的肝癌细胞BEL-7402凋亡率达(70.56±2.58)%,明显高于索拉菲尼组(45.38±1.76)%和CIK组(52.18±8.63)%(P<0.05).结论 索拉菲尼与细胞因子活化杀伤细胞疗法联合应用能明显增强对肝癌细胞的体外杀伤效应.     

中药启膈散免疫调节作用的体外实验研究

目的：探讨启膈散抗肿瘤作用的机制,为启膈散治疗肿瘤提供客观依据。方法：将实验细胞分为启膈散组、刀豆蛋白A（concanavalinA,ConA）组、脂多糖（lipopolysacchadde,LPS）组和空白对照组,ConA组及LPS组分别给予ConA、LPS5μg／ml,空白对照组不给药,采用MTT法观察50．00、25．00、12．50、6．25、3．13、1．63、0．78mg／ml启膈散水提取物对小鼠脾细胞体外增殖的促进作用,50．00、5．00、0．50mg／ml时对小鼠脾细胞分泌IL-2的影响;50．00、5．00、0．50mg／ml时对小鼠单核细胞分泌TNF-α的影响：50．00、5．00、0．50mg／ml时对NK细胞肿瘤细胞杀伤活性的影响。结果：启膈散显著刺激小鼠脾细胞增殖,且存在明显的量效关系;能显著提高小鼠脾细胞分泌IL-2的活性;促进小鼠单核细胞分泌TNF-α作用显著;可提高NK细胞对靶细胞的杀伤率。结论：启膈散的抗肿瘤活性可能与其免疫调节功能有关。