SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组cDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因.方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%.2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因.13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子.结论胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解.     

阴道毛滴虫cDNA文库的构建和鉴定

目的 :构建阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)全长cDNA表达文库 ,筛选全长目的基因 ,研究与其细胞周期相关基因的结构和功能。方法 :从Tv中提取总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库试剂盒构建其全长cDNA表达文库。结果 :所建文库的初始滴度为6 78× 10 6 pfu mL ,经一次扩增后的滴度为 1 6 8× 10 9pfu mL ,重组率 >98%。结论 :成功构建Tv全长cDNA文库 ,并从该文库中筛选出了与细胞周期相关的基因     

人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库的构建

目的为进一步获得人卵巢癌相关抗原基因,构建人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库.方法从人上皮性卵巢癌组织提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400 bp片段,收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人卵巢癌组织cDNA表达文库.结果经检测该原始文库滴度为5.5×106 pfu/ml,扩增后文库滴度为3.0×1011 pfu/ml,重组率96%.插入片段平均大小1.0 kb以上.结论所构建的人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库质量合格,为以后筛选获取卵巢癌特异性相关抗原基因或其它相关基因奠定了基础.     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

人源性大肠癌抗原基因噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法从人大肠癌组织中提取总RNA,用RT-PCR合成cDNA第1链,用LD-PCR合成cDNA第2链,除去小于500 bp的小片段,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成cDNA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,滴定文库的滴度,确定文库容量大小;用ITPG诱导和X-gal显色测定重组率;用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果构建成含2.39×106 pfu/ml重组噬菌体的人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,重组率为97.5%,插入cDNA片段大小范围从600~4 000 bp,平均长约1 400 bp。结论成功构建高质量人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因。     

华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

目的 构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30％左右,1kb～500bp占69％。结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库。     

恶性疟原虫基因组文库的构建及未知抗原cDNA片段的筛选

恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切，取14－23kb片段连接入GEW-11λ噬菌体置换型载体构建基因组文库。所得重组体数目为7.3×104pfu，近达构建完整恶性疟原虫基因组文库理论值的10倍。随机挑取该库10个噬菌斑，抽提λDNA，用XhoⅠ酶切，得到14－23kb的插入片段和载体双臂，符合建库要求．以抗体筛选恶性疟原虫cDNA表达文库所获得的未知抗原cDNA片段为探针，在其中筛选到了阳性克隆，为阐明该未知cDNA对应的基因奠定了基础．     

应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原

目的:应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原,为鼻咽癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测提供候选的生物学指标和理论基础。方法:从鼻咽癌新鲜活检组织中提取mRNA,构建cDNA表达文库。用鼻咽癌患者的血清筛选所构建的cDNA表达文库,获得的阳性克隆经扩增后提取噬菌粒DNA进行测序。所得序列与GenBank数据库中已知基因进行同源比较,分析其生物学特性。结果:所构建的cDNA原始文库含1×106个重组体,蓝白斑试验显示重组率为93%。用鼻咽癌血清对表达文库进行筛选,共获得21个阳性克隆,分别代表14个不同的cDNA插入片段。12个插入片段的DNA序列分别与基因库上的基因有不同程度的同源性,其中6个基因与鼻咽癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另6个基因的生理功能未见文献报道。2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论:SEREX技术是目前筛选肿瘤抗原最简便、有效的手段之一。本文研究发现的抗原将为鼻咽癌的研究提供进一步的理论基础。     

恒河猴(Macaca mulatta)肝脏cDNA文库的构建

目的 构建正常恒河猴的肝脏组织cDNA表达文库,以筛选恒河猴的相关基因并提供其作为医学研究动物模型的遗传学依据.方法 提取正常恒河猴肝脏组织总RNA,纯化的mRNA反转录合成cDNA,连接EcoR Ⅰ接头,经XhoⅠ酶切并用CHROMA SPIN-400分离cDNA,将大于500 bp的cDNA片段连接于λ ZAP表达载体,体外包装后转染至XL1-Blue MRF'宿主菌中,再扩增文库.对cDNA文库的滴度、重组率和插入片段的大小进行检测.结果 初始文库的库容量为1.2×106 pfu,初始文库和扩增文库的滴度分别为1.1×106 pfu/mL、 7.7×109 pfu/mL,重组率分别为99.3%、98.2%,插入片段平均长度分别为2.0 kb、2.3 kb.结论 成功构建了恒河猴肝脏组织的cDNA表达文库,为同种和异种移植以及移植相关药物临床前研究奠定了良好的基础.     

大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析

目的 克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA。方法 以大鼠大脑Marathon Ready cDNA为模板，采用SMART RACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA，产物亚克隆刘pGEM-T easy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析。结果 经过3次5’RACE扩增，得到的5号EST cDNA长度为5663bp，其中包含1个2136bp的完整的开放读码框序列，与已知大鼠基因芳香烃受体核转位因子2（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator2，Arnt2）完全同源：该cDNA 3’瑞非编码区长达3323bp，包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列。结论 5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2，该基因3’端完整的非编码区cDNA序列为首次报道。神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础。     

大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

从大鼠皮肤提取总RNA, 以P1 5′→3′TTCAGTCATGAGGATCCATTAC和P2 5′→3′ GGTTCTTGGTCTTTTTATCTAC引物,采用RT-PCR技术扩增得到一cDNA片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β-防御素-2和大鼠β-防御素-1进行同源性比较,结果显示,该cDNA片段编码的氨基酸序列具高度同源性(其成熟肽与hBD-2的同一性为50%,相似性为32%),均含6个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的cDNA为大鼠β-防御素-2亚类,因此命名为rBD-2.大鼠β-防御素-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似,能够被诱导表达.以上结果提示,β-防御素-2可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质.     

亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1（elongation factor 1,EF-1）基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：∥ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能。结果该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162。结论应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因。     

人IL-12 cDNA的克隆

目的: 克隆人IL-12的cDNA。方法：利用RT-PCR从人NC 37淋巴母细胞中克隆出IL-12中两个亚基p35和p40的cDNA并进行序列测定。结果：从NC 37细胞中克隆的p35 cDNA序列(GenBank登录号为AF 101062)与先前登录在GenBank上的M65271 (NC 37细胞来源）和M 65291(RPMI 8866细胞来源,美国专利号：5648467）的p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同：编码第44位氨基酸残基密码子的第3个碱基M 65291是C,而M 65271和本研究AF 101062的相应序列2是G;编码第244氨基酸残基密码子的第3个碱基,M 65271序列是C,而M 65291和AF 101062的相应序列是T;编码第247氨基酸残基密码子的第2个碱基M 65271序列是C,而M 65291和AF 101062的相应序列是T。此外,本研究克隆的p40 cDNA序列与登录在GenBank的p40 cDNA (M 38444)序列完全相同。结论：尽管本研究克隆的p35 cDNA序列与已知的两种p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同,但其编码的氨基酸序列却与专利登记的p35 cDNA（M 65291）编码的氨基酸序列完全一致,表明克隆的IL-12基因所表达的蛋白质在理论上是符合目前药用标准的。     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆与测序

目的探讨通过分子生物学技术克隆人铜锌超氧化物歧化酶的cDNA片段。方法从人正常肝细胞中提取总RNA,然后对其进行反转录产生第1条cDNA链。根据GeneBank中人铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）cDNA序列（序列号AB087266）设计1对PCR引物,对反转录后产生的第1条cDNA链进行PCR扩增,获得目的基因。结果获得459bp预期大小的PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳和测序验证,使用序列分析软件证明,提取的是所需要的hSOD1cDNA的片段。结论获得的目的片段纯度高,未降解,能满足进一步试验的需要。     

突变型IκBα cDNA的克隆及其表达载体的构建

大量研究显示，慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病以及淋巴细胞性白血病等均具有持续活化的核因子κB（nuclearfactor—κB，NF—κB）。因此，NF—κB的活化可能与白血病发生及其进展密切相关。NF—κB活化后，除了可调节参与细胞生长和增殖相关基因的表达外，还可上调凋亡抗性分子如cIAP1和TRAF1等基因的表达，从而使肿瘤细胞逃避凋亡。相反，抑制NF．κB活性，则能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。因此，研究白血病细胞NF—κB的活化及其调控对揭示白血病的发病机制以及寻找白血病治疗新的靶分子具有重要意义。     

人PPARγ2 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

目的克隆中国人的PPARγ2 cDNA,并在大肠杆菌中进行表达纯化.方法从正常人面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR及序列测定等方法获得人的PPARγ2 cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Western blot分析和用Ni2 -NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析.结果获得了正常中国人的PPARγ2 cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-PPARγ2;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量为56×103的PPARγ2目的蛋白;表达产物经Ni2 -NTA离子交换树脂纯化,PPARγ2蛋白的纯度大于90%以上.结论克隆得到正常中国人PPARγ2 cDNA的序列与Genebank报道的序列一致,并且在E.coli中成功表达和纯化了PPARγ2蛋白.此研究为后续PPARγ2功能活性和配体的筛选实验奠定了基础.     

应用全自动DNA测序仪测定人胰岛素cDNA碱基序列

糖尿病病因复杂 ,虽经多年不懈努力 ,但糖尿病的诊疗仍是一大难题。近年来 ,应用分子生物学技术 ,解决了很多疾病的诊治难题。因此若要彻底解决糖尿病诊治问题 ,应用分子生物学技术也许是一条捷径。在先期的工作中已获得人胰岛素ｃＤＮＡ克隆 ,本实验则对人胰岛素ｃＤＮＡ进行了测序。１材料与方法１．１人胰岛素ｃＤＮＡ克隆的获得由天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫研究室制备 ,方法从略。１．２人胰岛素ｃＤＮＡ序列的测定１．２．１模板的准备１．２．１．１质粒模板ＩＮＳ -１为构建的扩增质粒 ,即 ｐｕｃ１８ +人胰岛素ｃＤＮＡ ;ＩＮＳ …     

使用cDNA PCR-文库技术扩增感兴趣样品的cDNA

在病理学研究中对病变组织和正常组织进行基因表达差异的分析。可能获得与疾病发生发展相关联的致病基因。目前有一大批基因表达差异的分析技术，如表达序列标签（EST）、基因表达系列分析（SACE）、差异展示（DD—RTPCR）、代表性差异分析（RDA）、抑制性消减杂交（suppressive subtractive hybridization,SSH）以及基因芯片基础上的技术（cHp—based approach）等，但这些技术需要2—20μg不等的mRNA起始材料。随着显微切割技术的应用，精确获得感兴趣组织或细胞已经成为可能。而对精确获得的少量细胞样本与正常细胞进行基因表达类型的分析，变为将显微切割技术与基因表达差异分析技术结合为一体的一个障碍。笔者使用TaKaRa公司的cDNAPCR-文库（cDNAPCR—Library）技术对获得的eDNA样本进行扩增，并对此技术的优缺点进行分析。     

脑胶质瘤相关新基因PKIβ的表达与蛋白质性质的研究

目的 运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中1条基因进行了克隆和表达.方法 抽提正常成人脑组织与脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察二者表达谱的差异情况,对436F11克隆子进行Northern印迹,生物信息学分析和蛋白质的表达.结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达.BLASTn和BLASTx分析显示,436F11基因为全长新基因,共编码78个氨基酸,其理论相对分子质量为8468等电点为4.69,与鼠PKIβ69%同源,命名为人PKIβ.并在大肠杆菌中得到了PKIβ较高的表达蛋白,经纯化,在SDS-PAGE胶上获得了1条清晰的条带.氨基酸测序和分子量测定与生物信息学结果完全一致.结论 基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性.人PKIβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的1条全长新基因,这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路.