尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH的免疫保护作用

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用。方法选取BALB/c小鼠60只,随机分为3组(PBS对照组、空质粒对照组、疫苗免疫组),3组分别用构建成功的重组质粒pcDNA3.0-fimH(为疫苗免疫组),载体质粒(pcDNA3.0)(为空质粒对照组)和PBS液(为PBS对照组),经股四头肌注射免疫小鼠,于第21天和第35天加强免疫。于免疫第0、14、28及42天收集小鼠膀胱冲洗液,检测各组SIgA水平。于免疫第42天采血,检测各组特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。结果免疫后,疫苗免疫组小鼠膀胱灌洗液中sIgA水平随时间延长呈上升趋势,且明显高于PBS对照组及空质粒组(F=10.08,P<0.05);疫苗免疫组小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体均明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道具有一定的免疫保护作用。     

尿路致病性大肠埃希菌和宿主膀胱防御反应的相互作用

尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是大部分尿路感染的病原菌,大多数UPEC表面具有纤毛状的粘附器官-1型菌毛,1型菌毛介导细菌与膀胱上皮细胞接触,且侵入其中,UPEC侵入细胞后获得一个保护性环境,或在其中繁殖,或处于静止潜伏状态,具1型菌毛的UPEC侵入细胞引发了宿主的一系列反应;细胞激酶的产生,炎症反应和受感染膀胱上皮细胞的片状脱落,宿主反应和抗生素治疗虽能有效清除尿中细菌,但致病菌可顽固地存在于膀胱组织中,从而成为复发性尿路感染的难治根源。     

尿路致病性大肠埃希菌和宿主膀胱防御反应的相互作用

尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是大部分尿路感染的病 原菌。大多数UPEC表面具有纤毛状的粘附器官-1型菌毛。1型菌毛介导细菌与膀胱上皮细 胞接触,且侵入其中。UPEC侵入细胞后获得一个保护性环境,或在其中繁殖,或处于静止潜 伏状态。具1型菌毛的UPEC侵入细胞引发了宿主的一系列反应:细胞激酶的产生,炎症反应 和受感染膀胱上皮细胞的片状脱落。宿主反应和抗生素治疗虽能有效清除尿中细菌,但致病 菌可顽固地存在于膀胱组织中,从而成为复发性尿路感染的难治根源。     

尿路致病性大肠埃希菌1型菌毛、P型菌毛黏附能力与药敏情况之间的关系

目的研究尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)1型菌毛、P型菌毛的黏附情况及抗菌药物的药敏情况,分析二者的相互关系,为UPEC的治疗和预防提供新思路。方法收集UPEC菌株,采用梅里埃公司VitekⅡ进行细菌鉴定与13种常见抗菌药物的药敏试验,通过1型菌毛与酵母细胞的黏附实验、P型菌毛与人红细胞的黏附实验,分别检测1型菌毛、P型菌毛的黏附情况,比较两种菌毛黏附特性与药敏之间的关系。结果根据两种菌毛的黏附特性分为四组(1型阳性P型阳性组、1型阳性P型阴性组、1型阴性P型阳性组、1型阴性P型阴性组),比较各组间的药敏差异,结果显示头孢呋辛(χ2=16.42,P=0.001)在1型阴性P型阳性组耐药率低于其他组。分析单种菌毛黏附特性与药敏的关系,结果显示头孢呋辛(χ2=6.01,P=0.014)在1型菌毛黏附阳性组的耐药率高于阴性组。对药敏情况与两种菌毛黏附特性进行相关性分析时发现,1型菌毛黏附阳性菌株相较于阴性菌株,头孢西丁、哌拉西林/三唑巴坦的耐药率降低,头孢呋辛的耐药率增加,P型菌毛黏附阳性菌株相较于阴性菌株,头孢呋辛的耐药率降低。结论通过比较UPEC 1型菌毛、P型菌毛黏附与药敏的关系,在临床治疗UPEC所致尿路系统感染时,为抗菌药物的选择提供了新的方向。     

尿路致病性大肠埃希菌1型菌毛黏附特性与分子流行病学分析

目的 了解尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)1型菌毛黏附特性、耐药表型及分子流行病学特征,为临床诊疗提供理论基础。方法 收集2020年1-11月广东省中医院大学城医院临床分离的80株UPEC,利用VitekⅡ细菌鉴定药敏分析仪鉴定细菌并进行药敏实验。利用PCR方法检测UPEC的1型菌毛fimH基因的携带情况,酵母细胞黏附实验检测UPEC的黏附特性,比较黏附阳性UPEC和黏附阴性UPEC菌株间的抗生素耐药差异。通过随机扩增多态性DNA(RAPD)法分析黏附阳性UPEC间的亲缘关系。结果 80株UPEC中1型菌毛fimH基因阳性菌株为74株,占94.5%,其中黏附阳性菌株为37株,占50.0%。黏附阳性UPEC头孢呋辛耐药率(45.9%)和产超广谱β内酰胺酶(ESBL)阳性率(45.9%)均高于黏附阴性UPEC(21.6%、21.6%),差异均有统计学意义(P均<0.05)。37株黏附阳性UPEC可基因聚类,分为18个基因型,其中以R010基因型为主,包含11株UPEC,占29.7%;另外R006基因型包含4株UPEC,占10.8%;其余基因型均包含1～2株菌。结论 临床分离的UPEC...     

尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T敲除株的构建及功能评价

目的探索外膜蛋白T(OmpT)基因在尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)CFT073致尿路感染中的作用。方法利用RED重组技术构建UPEC CFT073 ompT基因缺失株(命名为COTD),并建立小鼠急性尿路感染模型,体内外实验比较野生株与敲除株之间在膀胱组织的定植能力。结果 PCR分析及测序鉴定证实ompT基因缺失株构建成功;体外实验结果显示野生株粘附率为(8.3±1.9)%,敲除株粘附率为(6.7±2.2)%,敲除株粘附率明显低于野生株(P<0.05)。体内实验膀胱组织内,野生株定植细菌数为(7±2)×105cfu,敲除株定植细菌数为(17±8)×104cfu,ompT敲除株定植于膀胱组织的能力明显降低(P<0.05)。结论证实OmpT作为毒力因子参与细菌定植膀胱组织,在UPEC致尿路感染的过程中发挥重要作用。     

致病性大肠埃希菌玻片凝集的模拟方法

目的在缺乏致病性大肠埃希菌株及其抗血清情况下，用普通大肠埃希菌和抗血清替代品即能开出致病性大肠埃希菌检验的实验，以减少实验开支。方法用鞣钙液代替OK血清，硫酸铝钾液代替。血清，分别与活的和死的大肠埃希菌做玻片凝集。结果鞣钙液与死、活大肠埃希菌都凝集；硫酸铝钾液只与死大肠埃希菌凝集，与活大肠埃希菌不凝集。结论采用该法可作为致病性大肠埃希菌玻片凝集反应的模拟方法。     

肠致病性大肠埃希菌病原学检验探析

目的:本文将对腹泻患儿进行肠致病性大肠埃希菌病原学检验,从而探讨肠致病性大肠埃希菌的病原学特点。方法:对所有腹泻患者进行粪便采集样本,之后应用病原学检验方法对样本中肠致病性大肠埃希菌进行分离,给予病原学检查,包括形态特征分析、培养特征分析以及生化反应特征分析等,得出结论。结果:231例腹泻患儿粪便样本中均检测出肠道致病性大肠埃希菌,检出率为100.00%。肠道致病性大肠埃希菌菌落呈现出灰色,可略带白色,菌落具有整齐的边缘以及光泽表面;对肠致病性大肠埃希菌进行革兰氏染色可知,其结果为阴性,无芽孢出现,但出现鞭毛,属于短小杆菌,两端呈现出圆顿形。结论:研究肠致病性大肠埃希菌的病原学特点能够有效提高肠道致病性大肠埃希菌引发腹泻等疾病的确诊率,使患者及时得到具有针对性的治疗措施,提高患者治疗效果。     

一起致病性大肠埃希菌致食物中毒的调查

目的 查明食物中毒原因,及时采取应急措施,杜绝类似事件发生.方法 采用《个案现场调查表》,对患者逐一调查,分析可疑食物,采集患者肛拭子、可疑食物（即食炒田螺）和生产可疑食物（即食炒田螺）的生产环境物品进行致病菌检测.结果 此次食物中毒平均潜伏期9h,食用即食炒田螺者发病较高,患者肛拭子、剩余即食炒田螺、加工用煲盖中检出致病性大肠埃希菌.结论 该起食物中毒由致病性大肠埃希菌污染即食炒田螺引起,推测即食炒田螺在养殖加工过程中被致病性大肠埃希菌污染.     

由致病性大肠埃希氏菌引起人猫食物中毒的报告

20 0 2年 12月 10日海安县农民吴某为女儿举行婚宴 ,将餐后的剩余饭菜投喂 2只家猫 ,约 4小时后 ,2只猫突然死亡 ;5小时后 ,就餐的 41人中 2 6人相继发病。经流行病学调查、临床特点的分析和病原体的分离鉴定 ,确定是由致病性大肠埃希氏菌引起人猫食物中毒 ,在海安地区是首次报道     

重组质粒pcDNA3.0-hugl-1转染结直肠癌细胞后生物学效应的观察

目的:观察外源基因hugl-1转染对结直肠癌LS174细胞生物学行为的影响，探讨hugl-1基因与结直肠肿瘤的相关性。方法:构建重组质粒pcDNA3.0-hugl-1，转染至结直肠癌细胞株LS174细胞中，RT-PCR、Western印迹检测转染后hugl-1 mRNA及蛋白的表达;通过软琼脂集落形成试验、划痕修复试验、细胞黏附试验及Transwell细胞侵袭试验等进一步对转染后LS174细胞增殖、黏附、运动和侵袭能力进行分析，并与空质粒载体及未转染LS174细胞作对照。结果:成功构建重组质粒pcDNA3.0-hugl-1;RT-PCR、Western印迹检测结果显示，重组体pcDNA3.0-hugl-1转染细胞株中hugl-1 mRNA及蛋白表达明显高于空载体转染及未转染组细胞(P＜0.05)。重组体转染组细胞克隆形成率(32.23%)与未转染及空载体转染组细胞相比(35.76%、33.91%)无明显改变;重组体转染组LS174细胞克隆的迁移细胞数(82.14±7.62)明显低于空载体组(135.61±3.74)及未转染组细胞(142.37±6.12，P<0.05);转染后120 min，重组体转染组LS174细胞克隆黏附力明显高于空载体组及未转染组(P<0.05);重组体转染组穿膜细胞数(63.7±8.0)明显少于空载体组及未转染组(158.3±16.5、156.3±13.0，P<0.05)。结论:人hugl-1基因表达上调能降低结直肠癌细胞迁移运动和侵袭能力，增加细胞黏附能力,但对肿瘤细胞增殖能力无明显影响；其表达降低可使肿瘤细胞播散。     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达

目的:为探究葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响，构建必要的分子工 具。方法:以pcDNATM4/TO/myc-His B为载体，构建在GLUT1第一个胞外区插入2×FLAG标签的重组质粒pcDNA4- 2×FLAG-GLUT1。将重组质粒转染到NIH/3T3细胞中，利用Western印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量 和细胞表面FLAG-GLUT1的表达水平。结果:酶切鉴定及DNA测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。通过识 别FLAG标签，利用Western印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达，流式细胞术结果显示，转染重组质粒 的细胞表面可检测到FLAG-GLUT1的表达，阳性群比例为（21.46 ± 2.375）%，明显高于对照组（0.01±0.00）%，差 异有统计学意义（t=9.035，P<0.01）。结论:成功构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1，为研究GLUT1蛋白磷酸化在 疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定

目的 构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒，为进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备。方法 从血细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B1与T载体连接后转化大肠杆菌JM109，LB平板培养基筛选菌落，提取质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4／HisMaxA载体。结果 获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，插入pcDNA4／HisMaxA载体部位正确。结论 重组人HIF-1α所选用的pcDNA4／HisMax可高表达目的基因，为利用其进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础。     

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定

目的构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒,为进行治疗性血管再生研究做准备。方法从Hela细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论重组的人HIF-1α,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,为利用其进行治疗性血管再生研究奠定了基础。     

间充质干细胞治疗1型糖尿病的免疫调节机制研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一类具有免疫调节功能的干细胞,近年来成为广为关注的有可能在抗移植排斥和自身免疫性疾病治疗中最有应用潜能的工具细胞。目前MSCs治疗1型糖尿病(T1DM)的机制依然不明了,途径主要有两个方向,一是直接在体外诱导MSCs分化为类胰岛细胞;二是通过利用MSCs的免疫调节途径,阻止T1DM自身免疫的发展。现仅针对MSCs治疗T1DM的免疫调节机制研究方面的进展进行综述。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌的表达和纯化

目的分析重组肠道病毒71型外壳蛋白VP1（EV71 VP1）在大肠杆菌的表达及其部位,纯化重组蛋白VP1,为后续制备抗VP1单克隆抗体奠定基础。方法采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导VP1在质粒转化菌BL21中的表达;用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blot分析VP1的表达形式和抗原性;优化EV71 VP1原核表达条件。结果 SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的VP1为一单一条带,相对分子质量约36 000,与预期大小相符;Western blot检测证实该蛋白能分别与兔抗EV71外膜蛋白和兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性结合,其最佳表达条件为37℃,1.25 mmol/L IPTG诱导4 h。结论原核表达了EV71 VP1,经纯化复性后VP1具有良好的抗原性,为后续工作奠定了基础。     

重组大肠杆菌表达的Ber e1纯化工艺中去除内毒素效果研究

目的 去除重组巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1(rBer e 1)溶液中的内毒素,为后续实验和重组过敏原蛋白的临床应用打下基础.方法 采用亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用以及Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用,比较这两个方案去除重组蛋白溶液中的内毒素效果.结果 亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为6.25 EU/ml,蛋白回收率为42.8％;Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为2.09 EU/ml,蛋白回收率为26.1％.结论 Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用蛋白溶液内毒素的去除效果较佳,且内毒素含量以及Triton X-114残留量均在《中国药典》的规定范围内.     

DNMT1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的.