利用噬菌体肽库技术筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽

目的 获得具有生物学活性的SARS病毒N蛋白表位模拟肽。方法 以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机十二肽库，并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆，最后用合成肽技术进行表位鉴定。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位， mAb C008 对应表位氨基酸序列为GXLXTPXXXXGT；mAb C039 对应表位氨基酸序列为TTLPXXXXAXXX。结论 用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARS N蛋白2个不同表位，为下一步开展用SARS表位研究病毒的制病机制、诊断、疫苗及治疗等奠定了基础。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙肝病毒（HCV）包膜蛋白（E2）特异性噬菌体模拟表位。方法：以抗－HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子，对噬菌体同七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增“的筛选过程，随机挑取50个克隆，经酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV E2抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位。结论：用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF-α的短肽序列

目的　对噬菌体环七肽库进行筛选,寻求可拮抗肿瘤坏死因子a（TNF-α）活性的小分子短肽。方法　以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库,双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果　ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现,其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合,DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为:c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为:c-（T/S）WLHWWA-c。结论　噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位,为TNFα结合肽。     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD模拟抗原表位的筛选及分析

目的:用抗-HSV-2gD单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机12肽库中筛选HSV-2gD抗原模拟表位序列.方法:利用HSV-2gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库,经四轮富集筛选,随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA进行序列测定,并利用生物信息学软件对包膜糖蛋白D(gD)进行B细胞抗原表位分析.结果:经四轮生物淘筛后,特异性噬菌体克隆得到了富集.经过对阳性克隆携带的随机12肽序列进行综合生物信息学分析,得到了PYH-H和P-PLW两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序.结论:用噬菌体随机12肽库成功筛选到了两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序,可模拟McAb针对的抗原表位,可能是HSV的替代抗原.该研究方法为研制更有效及更广谱的HSV基因疫苗提供了依据.     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

华支睾吸虫模拟抗原表位的筛选和鉴定

目的从噬菌体12肽库中筛选华支睾吸虫模拟抗原表位。方法应用噬菌体随机12肽库亲和筛选华支睾吸虫病患者混合血清IgG,经过3轮的淘筛,随机挑取蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性,挑选免疫活性较高的克隆进行序列分析及免疫学鉴定。结果8个阳性克隆测得6个DNA序列,Western-bloting显示6个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。结论应用噬菌体肽库筛选技术可以获得华支睾吸虫模拟抗原表位。     

大肠癌噬菌体展示肽库的构建及大肠癌早期检测分子的筛选

目的构建大肠癌噬菌体展示肽库,筛选用于大肠癌早期检测的分子标志。方法选取30例第二军医大学长海医院肛肠外科手术后立刻冻存的大肠癌组织标本构建T7噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集大肠癌组及非肿瘤对照组血清中的抗体进行5轮亲和筛选,富集大肠癌相关肽;随机挑取5轮筛选后的2000个噬菌体克隆,用ELISA方法进一步筛选与大肠癌患者血清和对照血清反应性存在差异的大肠癌相关标志物克隆,进行基因序列测定。应用通过Chilibot文献挖掘方法预测各克隆的蛋白功能,反证筛选结果。结果 (1)所建大肠癌噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,经PCR鉴定其重组率为60%,库容为1.8×106pfu。(2)共筛选出18个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白功能,其中12个与肿瘤的发生相关。结论应用ELISA对肿瘤重组抗原的噬菌体展示肽库进行筛选的方法 ,可以用来发现差异表达的抗原。所筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原可用于早期筛检大肠癌。     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定

目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.     

天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析

目的 通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法 用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果 每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C（PKC）的磷酸化位点具有同源序列。结论 噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。      

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

用抗HCV多抗从随机12肽库中筛选抗原表位

目的：用丙型肝炎患者血清中抗丙型肝炎病毒（HCV）抗体从噬菌体随机12肽库中筛选HCV抗原表位。方法：将丙型肝炎患者血清混合,提取纯化的IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆用ELISA法检测其特异性,对4个克隆进行测序。并用ELISA法检测噬菌体克隆的诊断价值。结果：3轮筛选的投入产出比逐轮升高,回收率从(4.6×10-4)%增加到(5.3×10-2)%,具有良好的富集效果。对从第3轮洗脱物中挑选出的18个克隆进行结合试验,发现所挑的克隆与丙型肝炎患者的多克隆抗体有较强的结合力。其中4个克隆测序显示为同一克隆（命名为C1）,其外源插入肽为GSMSPYVRWYTP。用C1检测20例丙型肝炎患者血清的检出率为85.0%。结论：成功地用噬菌体12肽库对丙型肝炎患者血清进行了模拟肽筛选,且得到的模拟肽分子C1具有一定的诊断价值。