人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

重组人骨形态发生蛋白—2／7融合基因的构建及其在大肠杆菌 …

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体,研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的０．３６ｋｂ基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７（ＢＭＰ－７）成熟肽的０．４４ｋｂ基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７融合基因;经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,温度诱导表达,表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

人骨形态发生蛋白-2的基因重组及其在大肠杆菌中的表达

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白２（ｈＢＭＰ２）。方法将包含ｈＢＭＰ２部分前肽和成熟肽的３′端７３０ｂｐｃＤＮＡ片段,插入原核表达载体ｐｋｐＬ３ａ的多克隆位点,构建成ｐＫｐＬ３ａ／ｈＢＭＰ２重组表达载体,转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,挑选阳性克隆,经诱导表达后用ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定。结果该克隆表达的ｈＢＭＰ２为ＭＷ２７０００,表达量占菌体总蛋白１０％,部分纯化后植入大鼠股部肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生及骨与软骨形成。结论说明重组ｈＢＭＰ２具有诱导异位骨与软骨形成的生物学功能。     

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达

在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗ＶＨ－ＴＮＦ融合蛋白基因。方法；在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Ｍｅｌ３的重链可变区基因，将此融合基因插入大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经凝血酶消化后，测定其对Ｌ９２９细胞的杀伤活性，并进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，用抗ＴＮＦ抗体进行蛋白印迹分析。     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对外源蛋白翻译速率的影响

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中５＇融合基因长度达１３００ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ中仅为３６ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ但两者表达水平却无显著差异，因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ＡＴＧ下游顺序仅需长约３６个核苷酸。     

期刊文摘

ＯＰＧ与ＭＢＰ融合蛋白在大肠杆菌中的表达[刘继中 ,纪宗玲 ,陈苏民 ,胡蕴玉 ,李　毅 ,张晓楠 .细胞与分子免疫学杂志 ,2 0 0 2 ;18(6 ) :5 5 1 5 5 3]　　目的　克隆人骨保护素 (ＯＰＧ)成熟肽段编码区基因 ,并在大肠杆菌中表达 .方法　采用ＲＴ ＩＦＣ ,扩增人ＯＰＧ成熟肽段编码区ｃＤＮＡ ,并克隆入原核表达载体 ｐＭＡＬ ｃ2ｘ中 ,转化ＢＬ2 1(ＤＥ3)ＰｌｙｓＳ大肠杆菌感受态细胞 .经 0 .1ｍｍｏｌ·Ｌ-1ＩＰＴＧ诱导后 ,收集菌体蛋白 ,进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定 .结果　获得人ＯＰＧ成熟肽段编码区ｃＤＮＡ …     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对…

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使     

人钙调素基因Ⅲ表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ），将其插入表达载体ｐＢＶ２００，构建重组表达质粒ｈＣａＭⅢ／ｐＢＶ２００，用酶切、ＤＮＡ测序、ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。用ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α使其表达ＣａＭ蛋白。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白，经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可观察到一分子量与理论值相符（约１７０００）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的２０％。进一步分析表达产物的性质表明，ＣａＭ主要以可溶性形式表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，１７０００的表达条带可与标准鼠抗ＣａＭＭｃＡｂ起特异反应。结论：重组人ＣａＭ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究ＣａＭ的生物学功能及研制抗ＣａＭ单克隆抗体奠定了基础     

基因重组人自管生长素衍生物Asp116His的原核表达

目的：在大肠杆菌骨表达基因重组人血管生长素衍生物Ａｓｐ１１６Ｈｉｓ（ｒｈＤ１１６Ｈ－ＡＮＧ）并恢复其天然活性。方法：采用Ｅｃｏｒ１和ＢａｍＨⅠ双酶切，重组构建ｐＢＶ２２０／Ｄ１１６Ｈ－ＡＮＧ表达载体，转化大肠杆菌ＴＧ１基因工程菌，温控表达，破菌提取包涵体，变性、溶解、纯化、复性、浓缩，以鸡胚绒毛尿囊膜法及ＲＮＡ降解试验测活。结果：成功表达ｒｈＤ１１６Ｈ－ＡＮＤ，表达量约３０％，经纯化、复性、测活，     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５α中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的９９％。经ＦａｃｔｏｒＸａ酶切后得到分子量约为１７０００的ｂＦＧＦ,其生物学活性ＥＤ５０为２２９ｎｇ／ｍｌ。结论：经ＰＣＲ方法扩增的ｂＦＧＦ可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础     

恶性疟基因工程疫苗的研究Ⅲ．恶性疟原虫保护性抗原复合基因在大肠杆菌中的表达及产物分析

将人工合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＢＶ２２０重组并转化大肠杆菌ＤＨ５χ，挑取工程菌进行发酵试验并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物。结果显示经温度诱导后的工程菌在相当于分子量１０ｋｄ和２５ｋｄ的位置出现表达产物的条带，扫描测定表达产物的量占菌体蛋白总量的５％左右。免疫印迹分析显示表达产物可与免抗恶性疟原虫多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示表达产物为具有恶性疟原虫抗原位点活性的重组复合蛋白。     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源,方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４￣５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体     

赖型钩体重组质粒pDJH2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为本重疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别一ＰＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化为大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达，结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ，ｐＤＪｒＢ能在大肠杆菌中一致，免疫印迹在６８ｋｄ处分别有印迹，用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强和株攻击，表现出免疫保护作用本实验结     

钩体017株基因库pDJH_2与L．alstoni重组DNA探针同源性及pDJH_2在大肠杆菌中表达产物的分析

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ＿２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。结果显示：该重组ＤＮＡ探针与ｐＤＪＨ＿２１．９ｋｂ插入片段同源；使用ＩＰＴＧ诱导重组质粒ｐＤＪＨ＿２后，其在大肠杆菌中表达了６８ｋｄ产物。经蛋白酶Ｋ消化、免疫印迹及斑点一酶联免疫吸附试验，提示此６８ｋｂ产物是蛋内质抗原；用该６８ｋｂ蛋白质抗原主动免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，可抵抗强毒力赖型钩体０１７株的攻击，表现出对小鼠的免疫保护性，从而为赖型钩体０１７株基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。此赖型０１７株钩体重组ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠杆茵中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１ｂ申，在大肠杆菌一成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导异位化骨的趋势。