bi-1短发夹状RNA重组真核表达质粒对鼻咽癌和卵巢癌细胞增殖的影响

目的 以真核表达质粒pmU6为基础,针对bi 1基因构建在细胞内表达短发夹状 RNA (shRNA) 的质粒载体,并观察它们对CNE 2Z、CNE 1、HO8910PM、HO8910细胞株生长增殖的影响。方法 人工合成bi 1寡核苷酸链,退火、定向克隆入pmU6载体中产生重组质粒,将重组质粒转染到细胞中,MTT比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果 与未处理组相比,bi 1shRNA对CNE 2Z、CNE 1、HO8910PM细胞株的生长增殖有明显的抑制作用,而对HO8910细胞株的生长增殖无明显抑制作用。结论 重组质粒能在细胞内表达shRNA,产生RNA干扰(RNA interference, RNAi)效应并特异性抑制靶细胞的生长增殖,为质粒介导的RNAi技术应用于鼻咽癌和卵巢癌的基因治疗提供一定的理论依据。     

质粒表达的短发夹状RNA特异性抑制鼻咽癌细胞的增殖

目的观察pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的bcl-xL短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)能否特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖.方法将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到人鼻咽癌CNE-2Z细胞株、卵巢癌HO-8910细胞株和正常人类肝脏L-O2细胞株中,流式细胞仪检测转染率,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果bcl-xLshRNA能特异地抑制CNE-2Z细胞株的生长增殖,而对正常人类肝脏细胞株的生长增殖和HO-8910细胞中的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的表达无抑制作用.结论pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能特异性抑制鼻咽癌细胞的生长增殖,为质粒介导的RNAi技术运用于肿瘤的基因治疗提供一定的理论依据.     

人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链，再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调，抑制率约达85％；同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。     

靶向VEGF发夹状RNA对宫颈癌HeLa细胞抑制作用的研究

目的:运用RNAi技术下调血管内皮生长因子(VEGF)在HeLa细胞中的表达,观察其对肿瘤细胞凋亡的影响,为人宫颈癌治疗提供理论依据。方法:设计并构建针对VEGF的携带绿色荧光蛋白(GFP)发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-shRNA),脂质体法转染HeLa细胞;荧光显微镜观察GFP的表达,并计算转染效率;RT-PCR检测HeLa细胞VEGF的表达,筛选出靶序列;再用流式细胞仪法检测细胞凋亡。结果:构建的PGPU6/GFP/Neo载体成功转入HeLa细胞;转染48h后,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞VEGFmRNA表达的抑制率为75.0%;与HeLa组和HeLa-shNC组相比,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞凋亡率明显增加,P<0.01。结论:本研究构建的PGPU6-shRNA表达载体携带GFP便于观察细胞的转染情况,且不影响U6启动子的转录,同时有效沉默了VEGF基因,明显增加HeLa细胞的凋亡,为未来肿瘤的治疗提供新途径。     

CRKL基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CBKL基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 将筛选确定的CRKL基因RNAi有效靶序列克隆到pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shCRKL慢病毒载体.通过酶切、测序验证后,用LV-shCRKL、pHelper 1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 载体片段插入正确.共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒LV-shCRKL.结论 成功构建了人CRKL基因RNAi病毒载体.     

利用报道基因检测鼻咽癌细胞的RNA干扰作用

背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)具有高效特异阻断基因表达的特点,在基因功能研究、信号转导通路的研究以及基因治疗中得到很广泛的应用。本实验通过体外转录合成siRNA和构建表达shRNA的质粒载体两种方法,检测鼻咽癌细胞系的RNAi作用,建立一个较完善的RNAi技术平台。方法:体外转录合成或通过pSUPER.retro构建表达针对GFP和荧光素酶的siRNAs或shRNAs,将它们和报道基因一起瞬时转染HeLa、CNE1、CNE2和5-8F细胞,用荧光显微镜和Westernblot检测GFP表达情况;用荧光素酶检测系统分析荧光素酶的活性。结果:3'末端带UU突出的siGFP2和psGFP能特异性地抑制细胞中GFP的表达,而单链反义RNA和3'末端不带UU突出的siGFP1无此作用。定量荧光素酶活性分析发现,siLuc能抑制HeLa、CNE1、CNE2和5-8F细胞中荧光素酶的表达,其抑制率分别达到91.43%,78.01%,90.30%和62.85%。HeLa细胞瞬时转染psLuc后,荧光素酶的表达抑制率可达到78.22%。结论:体外转录合成的siRNA和表达shRNA的质粒均能诱发RNAi效应。3'UU突出末端在siRNA诱发的RNAi中起作用。鼻咽癌细胞与HeLa细胞一样存在RNAi效应。     

靶向活化T细胞核因子1基因的shRNA质粒表达载体的构建

 目的　利用pRNAT-U6.1／Neo质粒构建靶向NFAT1基因的3个shRNA，为下一步探索肺癌基因治疗的RNA干扰途径奠定基础。方法　设计3对shRNA（NFAT1-sh-1、NFAT1-sh-2、NFAT1-sh-3），以人类基因同源性差的无关序列（NFAT1-sh-NC）作为阴性对照。筛选与人类其他基因同源性小、特异性针对目的基因的siRNA。合成并克隆至带有U6启动子的pRNAT -U6.1／Neo质粒中，构建质粒表达载体，通过凝胶电泳鉴定后转化至大肠杆菌中进行培养，并提取质粒进行DNA测序鉴定。结果　成功构建和筛选出靶向NFAT1基因的3对shRNA质粒表达载体，GC比例为40 ％～55 ％。结论　构建的3个靶向NFAT1基因shRNA质粒表达载体有助于肺癌靶向基因治疗RNA干扰的研究。为筛选有效的基因干扰载体，以及对荷瘤肺癌裸鼠靶向RNAi抗肿瘤细胞生长的研究鉴定了基础。     

短发夹状RNA介导的RNAi对白血病细胞株HL-60的抑制作用

目的 为探讨RNA干扰对HL-60细胞的抑制作用,构建survivin的短发夹状RNA真核表达载体并将其导入白血病细胞株HL-60细胞.方法 设计、合成两对针对survivin的短发夹状RNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pSINsi-hU6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2.pSIN/shRNA1转染HL-60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功.MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1进入HL-60细胞48、72、96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞仪分析pSIN/shRNA1细胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%(P＜0.05).结论 构建survivin基因RNAi真核表达载体成功;pSIN/shRNA1序列可特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡.     

Bcl-2短发夹状RNA对NB4细胞株生长的抑制作用

目的：构建Bcl-2短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的表达载体并研究其对早幼粒白血病细胞株NB4生长的抑制作用。方法：针对Bcl-2基因构建编码shRNA序列的重组表达载体．经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入NB4细胞后．通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率，采用Western Blot检测Bcl-2蛋白表达水平；采用MTT法测定细胞增殖情况。结果：编码Bcl-2 shRNA的RNA序列被正确地插入到预期位点。将两个Bcl-2 shRNA载体分别转入NB4细胞后，Bcl-2蛋白表达水平均降低．与转染阴性shRNA及未转染组比较，均有显著性差异（P〈0．05）。转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入NB4细胞在72、96h细胞生长明显受到抑制，分别与转染阴性shRNA、单纯载体组及未转染组比较，差异有显著性（P〈0．05）。结论：构建的两个Bcl-2 shRNA均可特异性地抑制NB4细胞生长。     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HER2的表达

[目的] 研究短发夹状RNA（short hairpin RNA；shRNA）对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2表达的影响。[方法] 将编码针对HER2的shRNA的寡核苷酸克隆入哺乳动物表达载体psilencer3．1-H1，形成pshRNA-HER2重组质粒，在多胺的介导下转染SKBr3，RT-PCR分析HER2 mRNA的表达，免疫细胞化学的方法检测蛋白的表达。[结果] DNA测序证实了表达质粒构建成功，与对照相比，shRNA可使HER2 mRNA的水平降低60％。[结论] 构建的pshRNA-HER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达。     

siMDR1重组慢病毒载体的构建及其对A549和A549／DDP细胞的影响

背景与目的:肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的最主要原因,也是癌症术后复发及转移的主要原因.本研究旨在探讨MDR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒对人肺腺癌A549细胞和对顺铂耐药的A549/DDP细胞的MDR1基因的抑制作用.方法:设计获得针对MDR1的短发卡状RNA(small hair pin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列,退火后插入线性化的pSUPER载体(H1启动子下游).把构建获得的载体转染A549细胞,RT-PCR法检测其对MDR1的干扰作用,筛选确定MDR1基因RNAi有效靶序列;合成靶序列的01igo DNA,与含启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PTM载体连接产生PTM-siMDR1慢病毒载体;用重组慢病毒体外感染A549和A549/DDP细胞.结果:成功构建可以表达针对MDR1的发卡状RNAi,能有效的下调MDR1的表达.成功构建获得针对MDR1基因的慢病毒载体PTM-siMDR1,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为0.5×109TU/mL.感染PTM-siMDRI的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显提高,逆转倍数达3.81倍.结论:siiDR1重组慢病毒载体感染A549/DDP细胞,能明显改善其对顺铂的耐药性.     

shRNA沉默EIF4E基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞VEGF-C表达的影响

目的:探讨shRNA沉默EIF4E基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞EIF4E及VEGF-C基因表达的影响.方法:制备针对EIF4E的三种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),分别是siRNA1、siRNA2、siRNA3,筛选沉默最有效的siRNA,据此设计短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)寡核苷酸链,与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接,构建pGPU6/GFP/Neo-EIF4E重组质粒,经酶切鉴定后利用脂质体LipofectamineTM2000将鉴定正确的重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学法检测EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达情况.结果:RT-PCR结果显示siRA1、siRNA2、siRNA3对乳腺癌MDA-MB-231细胞EIF4E基因表达均有抑制作用,与空白对照组、阴性对照组、脂质体组比较差异显著(P<0.05),尤以siRNA3抑制率最高达71.2%.利用针对siRNA3合成的shRNA与质粒载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E,酶切鉴定表明构建成功,并稳定转染MDA-MB-231细胞,平均转染效率为80%.RT-PCR、Western blot结果显示,稳定转染重组质粒后MDA-MB-231细胞EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05),抑制率分别为79.00%、67.90%(EIF4E)和77.01%、62.94%(VEGF-C).免疫细胞化学染色法显示重组质粒组EIF4E及VEGF-C蛋白表达均受到明显抑制(P<0.05).结论:靶向EIF4E的shRNA不仅能有效沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中EIF4E的表达,且能抑制VEGF-C的表达,提示EIF4E可能参与诱导乳腺癌细胞VEGF-C的表达,而EIF4E-shRNA可能成为抑制乳腺癌淋巴管生成的一种新的有效手段.     

Livin基因RNAi表达载体的构建及其沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并观察该载体对Livin基因表达的沉默效应.方法:设计并合成4个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pGCL-GFP慢病毒表达载体,转化,扩增后测序.以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列的特异性片段,连接,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG.将构建好的Livin基因过表达克隆质粒和不同靶点的RNAi表达载体质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染人人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果.结果:Livin基因RNAi的表达载体pGCL-GFP-shLivin和Livin基因过表达载体pdsRED2-N1-Livin的阳性克隆序列正确.人293T细胞Livin蛋白表达90%被阻断.结论:成功构建高效阻断Livin基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究Livin基因的生物学功能奠定基础.     

TIZ基因mRNA在卵巢癌细胞系中的表达及其RNA干扰载体构建

目的检测卵巢癌细胞株中TIZ基因的mRNA表达水平,并构建TIZ基因的特异性RNA干扰（RNAi）载体。方法通过RT-PCR方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、SKOV3顺铂耐药细胞、SKOV3卡铂耐药细胞、A2780、A2780卡铂耐药细胞、H08910）中TIZmRNA的表达;根据Genebank上TIZ的mRNA序列,设计5对siRNA干扰片段,采用脂质体转染法介导siRNA干扰片段并下调卵巢癌细胞系中TIZmRNA的表达。采用pTG19-T质粒构建TIZ和β-actintmRNA表达重组质粒并制备其标准品。采用实时定量PCR（QRT—PCR）检测siRNA干扰片段对TIZ基因的下降效率,并筛选最佳siRNA干扰片段。以pGPU6／GFP／Neo载体和质粒DNA测序方法构建pGPU6／GFP／Neo-siRNA—TIZ-573重组质粒。结果①除卵巢癌细胞H08910细胞无TIZ基因mRNA表达外,其余细胞均有TIZ基因mRNA表达。②细胞siRNA干扰片段筛选结果显示介导TIZ-573片段后可下调60％细胞TIZmRNA表达。③成功构建了TIZ基因RNAi载体pG-PU6／GFP／Neo-TIZ-573。结论多数卵巢癌细胞系表达TIZmRNA。siRNA-TIZ-573为最佳下调细胞TIZmRNA片段。构建的pGPU6／GFP／Neo-TIZ-573重组质粒可用于下一步的实验研究。     

siRNA表达载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制研究

目的探讨经载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制效率。方法针对周期蛋白E1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段，连接到pSilencer1．0-U6载体上构建siRNA真核表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转人BEL-7402肝癌细胞株。RT—PCR分析周期蛋白E1表达抑制率；流式细胞术测细胞周期S期和凋亡细胞比率；MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。结果重组载体介导肝癌细胞BEL-7402周期蛋白E1抑制率达62％；转染重组质粒32h测得S期细胞为19％，空载体转染对照为27％；转染重组质粒96h流式细胞术测得凋亡细胞为13．1％，高于空载体对照的6．6％；细胞生长曲线作图表明，重组载体转染组细胞生长明显减缓。结论肝癌细胞周期蛋白E1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰成功抑制，进而导致细胞生长受抑并诱导凋亡；本研究为探索肝癌的RNAi治疗提供了初步的实验依据。     

肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体的构建及其在前列腺癌细胞中的RNA干涉作用

目的:构建含Survivin基因启动子的、肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体,研究该载体在前列腺癌细胞中的RNA沉默作用。方法:运用分子克隆技术,选取Survivin、Livin基因RNAi特异性序列,构建以Survivin、Livin基因为靶点的、含Survivin启动子的CGM30 miR-30 shRNA载体。经测序验证,用脂质体法转染PC-3细胞,RT-PCR、免疫印迹实验检测Survivin、Livin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化。结果:构建的共沉默RNAi重组载体转染PC-3细胞后,Survivin、Livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达均明显下调（P＜0.01）,且转染后的细胞凋亡增加了约15％,而正常前列腺上皮BPH-1细胞中则无此作用。结论:成功构建了含Survivin启动子、特异性沉默Survivin、Livin基因表达的RNAi共沉默载体CGM30-SP-svv-liv,转染该重组质粒后可促进肿瘤细胞的凋亡。     

Survivin短发夹状RNA对结肠癌SW480细胞增殖和细胞周期的影响

[目的]构建survivin基因的短发夹状RNA（shRNA）表达质粒．检测它对结肠癌细胞增殖的影响。[方法]选用载体介导的RNAi技术，Westem blot检测SW480细胞转染后survivin水平的变化，流式细胞仪及MTT法检测细胞周期和细胞增殖的变化。[结果]Survivin短发夹状RNA可下调SW480细胞中survivin的表达，抑制率为60．68％，细胞周期分析显示将该细胞阻断在G2／M期，细胞增殖抑制：[结论]靶向survivin的shRNA可以降低survivin蛋白的表达，抑制结肠癌细胞的增殖。     

Survivin短发夹状RNA对结肠癌SW480细胞增殖和细胞周期的影响

[目的]构建survivin基因的短发夹状RNA（shRNA）表达质粒．检测它对结肠癌细胞增殖的影响。[方法]选用载体介导的RNAi技术，Westem blot检测SW480细胞转染后survivin水平的变化，流式细胞仪及MTT法检测细胞周期和细胞增殖的变化。[结果]Survivin短发夹状RNA可下调SW480细胞中survivin的表达，抑制率为60．68％，细胞周期分析显示将该细胞阻断在G2／M期，细胞增殖抑制：[结论]靶向survivin的shRNA可以降低survivin蛋白的表达，抑制结肠癌细胞的增殖。     

组蛋白赖氨酸转移酶KAT6B基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 在乳腺癌细胞T47D中利用构建的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体对赖氨酸乙酰转移酶6B(KAT6B/MORF)基因进行RNA干扰,通过下调该基因的表达来研究其对乳腺癌细胞的抑制功能。方法 针对KAT6B基因的CDS区合成2对单链的短发卡RNA(shRNA5、shRNA8)及相应的对照组序列(Scramble5、Scramble8),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增后,与双酶切(EcoRl、Xhol)线性化处理的入门载体(pENTR/pSM2(CMV)GFP)同源重组,获得含有目的片段的入门克隆。再通过Gateway系统的LR克隆反应,将目的片段重组到目的载体(pLenti x1 puro DEST)上。利用慢病毒包装系统,将慢病毒包装质粒分别与构建好的两对目的质粒共转染到HEK-293T细胞中,收集病毒上清,转导乳腺癌细胞T47D。最后,通过免疫印迹法(Western blot)检测KAT6B的表达。结果 对转化获得的单菌落进行测序鉴定,与目标序列完全一致,表明已经成功构建慢病毒载体。Western blot结果显示KAT6B基因的蛋白表达量在每组shRNA中都比相应的对照组显著降低,表明构建的基因沉默载体在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因具有基因沉默作用。结论 本研究通过构建KAT6B基因的shRNA慢病毒基因沉默载体,在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因进行RNA干扰的研究,为进一步研究KAT6B基因在乳腺癌中发挥肿瘤抑制作用奠定了基础。