金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的克隆、鉴定与扩增

目的 克隆SEA基因作为后续基因治疗的目的基因。方法 以金黄色葡萄球茵基因组DNA(ATCC-13565)为模板,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因特异性引物为介导，采用普通PCR和降落PCR方法分别克隆SEA基因全序列，克隆入T载体后进行DNA测序。结果 2％琼脂糖凝脂电泳和DNA测序证实该基因克隆成功。结论 通过PCR方法，可以获得后续实验所需的SEA基因。     

人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析

目的：克隆Survivin基因的cDNA，为分子信标定量检测其mRNA提供模板标准物。方法：以国人胎脾为材料提取总RNA作为模板，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增并克隆Survivin cDNA，并将其重组到pUCl8质粒中，用双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：克隆的Survivin cDNA序列与Gene Bank中的该基因序列相比较仅有1个碱基出现差别，并导致编码相应氨基酸的改变。结论：成功构建了Survivin基因的cDNA克隆，为建立Survivin基因mRNA的定量检测方法奠定了基础。     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建Ⅲ.变形链球菌表面蛋白PAc编码基因pac的体外扩增

目的 获取完整的变形链球茵表面蛋白PAc的编码基因pac。方法 建立扩增长片段目的基因的PCR反应体系，根据文献报道的pac核苷酸序列设计引物，使用通用缓冲液和高纯度的质粒pPC4l DNA为模板，经PCR扩增pac基因。结果 扩增产物经琼脂糖电泳和分子量鉴定，为单一的4．7kb条带。结论 成功地从质粒pPC4l DNA模板上扩增到全长4．7kb的完整pac基因，为下一步的防龋核酸疫苗的研究提供了物质基础。     

HCVNS5B区序列克隆和重组质粒的构建

选ＨＣＶ２ｂ基因型的ＮＳ５Ｂ区序更合成引的，以ＲＴ－ＰＣＲ从慢性丙肝病人血清中扩增一段４０１ｂｐ的ｃＤＮＡ片断作目的基因，插入ｐＴＤ－Ｔ７的多克隆位点，构建了重组质粒ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ。应用ＥＣＯＲＩ ＢａｍＨＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，酶切片断的分子量与预期相符。用载体序列特异的通用引物进行测序分析证实ｐＴＤ－ＨＣＶ－ＮＳ５Ｂ中克隆基因是ＨＣＶ２ｂ的ＮＳ６Ｂ６序列，且为正方向插入。     

中国南京TTV部分基因的克隆及对其扩增物序列的测定

目的 了解中国南京地区有无TT病毒(TTV)感染。方法采用套式聚合酶链反应(PCR)检测病因未明的肝炎患者血清中的TTV-DNA,并对PCR扩增产物进行序列测定。结果 在14例非甲～戊型肝炎患者的血清中,共检出8例TTVDNA阳性者,对其中一株进行序列测定,该序列与日本TTV部分基因(CLON22)和TTV中国株1相对应位置的核苷酸同源性很高,分别达97.65％和98.99％。结论 在中国南京地区的肝炎患者中存在着TTV感染。     

hTPO膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的:探索克隆人甲状腺过氧化物酶(hTPO)膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体。方法:PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coliDH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体(hTPO-Bacmid),每一步均以PCR及酶切、基因测序等方法鉴定其正确性。结果:与预期一致,PCR扩增hTPO膜外区基因的产物为一约2.5kb的条带;hTPO-pGEM3zf(+)经EcoRⅠ+HindⅢ、EcoRⅠ+SalⅠ双酶切后均获得2.5和3.2kb条带;hTPO-pFastBAC1以EcoRⅠ+HindⅢ双酶切得到2.5和4.8kb的带,均符合预期。分别以重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒为模板进行PCR扩增鉴定,均得到约2.5kb的目的条带;对hTPO-Bacmid进行PCR鉴定,得到约4.8kb的片段。对hTPO-pFastBAC1上下游接口测序正确无误。结论:本研究成功克隆了hTPO膜外区基因,并完成了其杆状病毒表达载体hTPO-Bacmid的构建。     

基因扩增法检测沙眼衣原体DNA的研究

建立检测沙眼衣原体（Ct）DNA的聚合酶链反应（PCR）方法，以间接血凝试验（IHA）对照。89例生殖道标本同时用两法检测，Ct阳性率分别为25．7％和11．1％。统计学分析表明，PCR阳性检测率显著高于IHA法，是检测Ct的理想方法。     

人SRY基因核心序列的扩增和分析

根据人ＳＲＹ基因序列，设计合成一对引物，在男性ＤＮＡ中特异扩增一条４２２ｂｐ的ＤＮＡ片段，而女性中无任何扩增带出现，进一步将该片段克隆，限制性内切酶分析和测试表明，扩增片段就是ＳＲＹ基因的保守区，随后利用其作探针进行分子杂交，在男性ＤＮＡ中获得一个约１２ｋｂ的带，与文献相一致，因此，利用该引物或克隆片段，在临床上可用于性宫锁遗传病的产前诊断和性分化异常个体的研究。     

突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达

目的：通过基因工程的方法将ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ基因改造以得到更加稳定的酶。方法：以本实验室构建的 ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ为模板,利用含有突变核苷酸的引物进行 ＰＣＲ扩增,将正确测定的含 ｒｈＣｕ, Ｚｎ－ＳＯＤ突变（ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ）基因的重组质粒重组到表达载体ＰＥＴ－２２ｂ（＋）中,重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ。结果：表达产物占菌体总蛋白的３８％,具有特异性ＳＯＤ酶活性。结论：从基因突变的角度改善酶的性能不仅具有理论意义,又有一定的实用价值。     

结核分支杆菌DNA不同制备方法对PCR扩增结果的影响

聚合酶链反应(PCR)在结核分支杆菌检测中的应用日益广泛,结核菌模板的制备对于基因扩增至关重要。由于结核菌细胞壁脂类含量达 41%,其中大部分属蜡质,故该菌胞壁坚韧,一般的裂解剂不能将结核菌破坏,裂解效果不理想,传统的 DNA提取方法操作繁杂,不适于临床应用。所以探索快速、简便和灵敏的模板制备方法具有重要意义。我们采用Triton-X100和SDS两种方法裂解结核菌,提供基因扩增的模板,取得了满意效果,现报告如下。 材料与方法 1.菌种来源及菌悬液的制备10例结核分支杆菌临床分离株均来自河北省胸科医院检验科。从改良罗氏培养基上取菌放…     

中国人血小板生成素基因的克隆

从5mo龄水囊引产胎儿肝脏中分离提取mRNA，经反转录PCR方法扩增出中国人全长血小板生成素（TPO）cDNA，然后将该cDNA片段重组入pGEM3Zf载体，并进行了限制性内切酶鉴定与序列分析，该cDNA全长1059bP，编码353个氨基酸。为开展TPO在真核细胞中的表达打下了基础。     

PCR扩增rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用

PCR技术以其快速及准确的优点已广泛应用于微生物检测与菌种鉴定中。本文重点从16SrRNA序列、16S—23S rRNA间隔序列、5S rRNA序列及tRNA基因序列扩增四个方面介绍了近年来PCR技术在细菌菌种鉴定中的应用。     

人甲胎蛋白转录调控序列的研究进展

人甲胎蛋白(AFP)基因的转录受控于5'-侧翼序列的三种调控区域,即启动子、增强子和沉寂子.AFP启动子是一个典型的肿瘤特异性的启动子,非常适宜于肝细胞癌(HCC)基因治疗,但由于它作用比较弱,在决定胎儿肝脏和HCC的AFP表达水平上,发挥主要作用的是增强子.如何增强人AFP转录调控序列的转录活性,是当前HCC靶向基因治疗研究的重要方面,本文对该三种调控区域的研究进展和应用作一综述.     

人甲胎蛋白转录调控序列的研究进展

人甲胎蛋白(AFP)基因的转录受控于5'-侧翼序列的三种调控区域,即启动子、增强子和沉寂子.AFP启动子是一个典型的肿瘤特异性的启动子,非常适宜于肝细胞癌(HCC)基因治疗,但由于它作用比较弱,在决定胎儿肝脏和HCC的AFP表达水平上,发挥主要作用的是增强子.如何增强人AFP转录调控序列的转录活性,是当前HCC靶向基因治疗研究的重要方面,本文对该三种调控区域的研究进展和应用作一综述.     

用于血纸片扩增人雌激素受体基因

为解决外地特别是边远地区人群作分子生物学检测标本取样难的问题，建立了用干血纸片直接PCR扩增或将干血纸片中的血细胞洗脱裂解后进行PCR扩增雌激素受体（PCR）基因的方法，结合已建立的RFLP分析、SSCP及DNA直接测序等方法，可对ER基因进行多态性、突变分析。干血纸片取样及保存容易，便于邮寄，适用于外地，特别是边远地区的样本采集，该法不仅能够简便易行的运用于雌激素和雌激素受体相关疾病患者的基因多态性和突变分析、家系调查和产前诊断，也适应于PCR基础上的其他各种基因的分析。     

南京地区TTV部分基因的克隆及序列测定

目的：了解中国南京地区有无输血传播病毒（TTV）感染。方法：用套式聚合酶链反应（PCR）检测病因未明肝炎患者血清中TTVDNA，并对PCR扩增产物进行序列测定。结果：14例非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTVDNA阳性者，对其中一株进行序列测定，该序列与日本TTV部分基因（CLON_22）和TTV中国株1相对应位置的核苷酸同源性很高，分别达97.65％和98.99％。结论：中国南京地区肝炎患者存在TTV感染。     

静脉血中微量肝癌细胞的检测方法

用聚合酶链反应法检测肝细胞癌病人静脉血中微量癌细胞，设计了两对特异引物，ＰＣＲ反应后出现与已知序列相符的１０１ｂｐ条带，并用Ｐｓｔｌ限制性内切酶消化确认其特异性。套式ＰＣＲ灵敏度达０．０１ｆｇ重组ＤＮＡ，在５ｍｌ静脉血中有１～１０个癌细胞即可识别，且重复性好。该方法可广泛地用于肝癌的早期诊断及转移机制的基础研究。     

肺炎克雷伯氏菌SHV-28编码基因的克隆、测序及基因定位

以临床分离的一株肺炎克雷伯氏菌99-799株为研究对象，对其所产生的一种β-内酰胺酶编码基因的序列、亚型及基因定位进行研究。采用聚合酶链反应(PCR)，用β-内酰胺酶通用引物、blasHv引物扩增获得β-内酰胺酶及SHV型酶编码基因的片段，将SHV型酶PCR扩增产物克隆入pUCm—T载体，以双脱氧链终止法测定核苷酸序列，再通过GeneBank进行同源性检测确定其亚型和基因所在位置。肺炎克雷伯氏菌99—799株所含的一种β-内酰胺酶基因型为SHV型，与SHV-28编码基因序列完全相同，且位于细菌150bp的大质粒上，说明重庆地区有SHV-28亚型的存在。