逆向斑点杂交同时检测DHBV DNA及其特异多聚酶方法的建立和应用

本文将检测HBV的逆向斑点杂交技术运用于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的研究,建立了同时检测DHBV DNA和DHBV DNA多聚酶(DNAp)的方法。经血清稀释试验证明,此方法高度敏感,能在1:256稀释、DHBV DNA少至0.39Pg的血清中测到有别于阴性对照的阳性结果。逆向斑点杂交不仅敏感,而且特异,从未有一例阴性或阳性对照出现假阳性或假阴     

HBV、DNA斑点杂交半定量分析之探讨

检出HBVDNA是乙型肝炎病毒在体内感染及病毒复制的直接证据。我们利用斑点杂交法定性试剂对乙肝患者血清中HBVDNA的含量进行半定量检测 ,为临床了解病毒复制及转归 ,评估疗效提供较为科学的依据。1　材料与方法1 .1　材　料1 .1 .1　标本收集 :标本采集于经本院研究室行HBVDNAPCR荧光定量检测血清 ,每份均提供了定量数据 ,共 1 80份 ,其中 2 4份PCR荧光定量小于 1 0 3拷贝 /ml(阴性 ) ,其余均大于 1 0 3拷贝 /ml(阳性 )。1 .1 .2　斑点杂交试剂盒 :由上海医科大学源力试剂公司提供的定性的“地高辛标记HBVDNA检测试剂盒”。1 .1…     

一种快速、简便检测鸭乙型肝炎病毒抗原、抗体的方法

本文报道检测鸭乙型肝炎表面抗原(DHBsAg)及抗体的斑点酶免疫测定法(Dot Euzyme Immunoassay,Dot EIA)。以硝基纤维素膜为载体依次加被检血清、抗DHBV免疫血清、辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA-酶结合物),可测标本中DHBsAg。依次加纯化DHBV、被检血清、SPA-酶结合物则可测血清中抗体及效价。用此法检测自然感染鸭血清40份,实验感染鸭血清220份,并与DHBV核酸斑点杂交法比较分析,两种方法符合率94.2％。用本方法测定本室制备的兔抗DHBV免疫血清,抗体效阶为1/3200。Dot EIA简单、快速、敏感、特异,是研究DHBV较有实用价值的一种方法。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

对流免疫电泳技术检测鸭血清中DHBsAg

用CsCl密度梯度离心法提纯鸭血清中的鸭乙型肝炎病毒表面抗原(D-HBsAg)。以纯化的DHBsAg加等量弗氏佐剂对家兔免疫3次,第3次免疫2周后采血,分离血清,用正常鸭血清对其吸收,得到初步纯化的抗血清,用此作为抗DHBsAg之抗体,用对流免疫电泳技术(CIEP)检测DHBsAg,检测101份,与DHBV DNA斑点杂交法比较,结果:CIEP敏感度80.43%,特异度92.73%,一致性87.13%。重复试验结果相同,表明可用于对鸭血清中的DHBsAg的初步筛选。     

斑点杂交法检测SEN病毒感染

目的:探讨斑点杂交法检测SEN病毒(SENV)感染的应用价值.方法:应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENV DNA,与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较. 结果: 在191份血清中,采用斑点杂交法检出6份阳性,检出率为3.1%. PCR方法检测出11份阳性,阳性率5.8%. 结论: 制备的地高辛探针具有SENV特异性,以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染.     

乙型肝炎病毒在宿主内不受核苷类药物影响的机理探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒在宿主中不受药物影响而得以长期与宿主共存的机理。方法 以核苷类药物拉米夫定（3TC）和无环鸟苷（ACV）对鸭乙肝病毒（DHBV）感染一日龄广州麻鸭模型进行治疗，以斑点杂交法检测治疗前后和停药后鸭血清中鸭乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（DHBV－DNA）的变化，并取提鸭的肝，肾，脾，肺，心组织中的DNA，用聚合酶链反应（PCR）方法检测DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况。结果 以斑点杂交法检测鸭血清DHBV－DNA，3TC和ACV两个治疗组在治疗后5－10d内血清DHBV－DNA含量持续下降（与模型组比较均P＜0．05），但停药后有回升倾向；用PCR方法检测各组的肝，肾，脾，肺，心组织，显示治疗后DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况与模型组比无显著性差异（P＞0．05）。进一步比较了斑点杂交法和PCR法检测的结果，显示斑点杂交法检测组织中病毒远不如PCR法敏感，并提示可能组织中病毒复制量很低，以致用斑点杂交法检测出现很多假阴性。结论 乙型肝炎病毒感染宿主后，药物治疗只对宿主血清DHBV－DNA含量有影响，但未发现对肝和肝外脏器组织中DHBV－DNA有影响，乙肝病毒不受药物影响而长期在宿主中存在并低水平持续复制，可导致宿主机体对其无法识别和清除而形成慢性感染。建议使用较敏感的PCR法监控组织中DHBV－DNA含量，作为评价药物长期疗效的指标之一。     

鹅血清中发现鸭乙型肝炎病毒样颗粒

用DNA斑点杂交、电镜、免疫电镜和斑点酶免疫法(Dot EIA),在鹅血清中发现一种与鸭乙型肝炎病毒(DHBV)相似的病毒颗粒。用DNA斑点杂交法和Dot EIA在鹅群中测得DHBV DNA和DHBsAg的阳性率均为32.43%(12/37)。对阳性血清进行电镜观察,见到直径30～60nm的球型颗粒,形态与DHBV相似。抗DHBsAg能使病毒颗粒发生凝聚。用CsCl密度梯度法对DHBV阳性血清进行超速离心,发现病毒颗粒分布在1.16～1.24g/ml的密度范围内,与DHBV的密度范围(1.15～1.25g/ml)接近一致,表明鹅血清中的病毒颗粒,不仅在形态学上与DHBV相似,且核酸序列与DHBV也有同源性,由其编码产生的表面抗原成分与DHBsAg有共同的抗原性。作者提出,这种病毒可能是1.独立存在于鹅体内的一种新的DNA病毒,与肝脏的关系有待探讨;2.作用于不同宿主的DHBV;3.DHBV的不同亚型。     

东北家鸭乙型肝炎病毒同人的乙型肝炎病毒交叉反应的研究

本文对东北局部地区麻鸭乙型肝炎病毒(DHBV)和肝病进行检测,证实东北家鸭存在DHBV感染。血清学检测,采用固相放射免疫法和DNA探针,结果表明,DHBsAg与HBsAg和DHBcAb和HBcAb有交叉反应,DHBV DNA与HBV DNA可以杂交。血清交叉反应阳性鸭血清免疫电镜见病毒颗粒聚集成团或互相连结成串。病理组织学检查表明本组家鸭DHBV携带状态与非携带状态肝病无显著差异。同时本文也发现DHBV与HBV的交叉反应检测受检测试剂盒的影响。     

重庆麻鸭乙型肝炎病毒感染率流行病学调查研究

目的:调查研究重庆地区成年麻鸭鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)感染率及其季节差异性,为优化DHBV研究模型奠定基础.方法:2009年春季与夏季随机采集重庆麻鸭血清560份,采用随机引物法地高辛素标记DHBV DNA探针,斑点杂交检测麻鸭血清DHBV DNA感染率.结果:重庆地区麻鸭春季DHBV感染率为1.82%,夏季DHBV感染率为5.26%,后者显著高于前者(P＜0.05).结论:重庆地区成年麻鸭DHBV感染率夏季高于春季,但均低于国内其他地区鸭DHBV感染率.     

清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目的观察清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎（DHBV）作用。方法用Dot—BLOT法筛选出DHBsAg强阳性1d龄华南麻鸭。随机分为5组，分别为模型组、拉米夫定（ACV）组和清肝排毒饮大、中、小剂量组。除模型组外，其他各组均灌胃口服治疗10d，于用药前（T0）、用药第5d（T5）、第10d（T10）厦停药后第3d（P3）分别采血，采用斑点杂交方法检测用药前后鸭血清乙肝病毒脱氧核糖核酸（DHBV DNA）的动态变化。结果清肝排毒饮中剂量治疗组第5、10d鸭血清DHBV DNA OD值明显低于培药前，差异有显著性（P〈0．05），但与拉米夫定组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。停药3d后无反跳。结论清肝排毒饮有一定的抑制DHBV DNA复制作用。     

生物素标记HBV DNA探针在肝石蜡切片上作原位杂交技术的研究——Ⅱ、与斑点杂交、吸印杂交的比较

对生物素标记HBV DNA探针的原位杂交与~(32)P标记的HBV DNA探针的斑点杂交和吸印杂交作了比较。三者阳性率分别为33.33％(25/75)、36.36(16/44)和15.38％(4/26),三者无统计学差异。16例同时用原位杂交和吸印杂交检测,4例二者均为阳性,9例二者均为阴性,原位杂交多检出3例阳性,二者有显著的相关性(p=0.0192)。30例同时作了原位杂交和斑点杂交,其中17例结果一致,13例结果不一致,两者无显著相关性(p>0.05)。并比较了原位杂交与其它两种杂交方法的优缺点。     

野水鸭等携带鸭乙型肝炎病毒的研究初报

本文应用斑点分子杂交（Dotblot）和斑点酶免疫测定法（DotEIA）对广州和海南地区3个鸭种携带鸭乙型肝炎病毒（DHBV）进行了调查，38只野水鸭血清标本DHBV自然感染率为63．2％（24／38）．其一日龄雏鸭DHBVDNA阳性率为80％（8／10）。在国内外未见类似报导。应用野水鸭阳性DHBVDNA血清以0．02～0．2ml／只量感染8只1日龄DHBVDNA阴性的广州麻鸭，获得100％感染，且病毒血症至少可持续60天，该野水鸭经鉴定为驯养的野生绿头鸭种，此将为DHBV基因分析比较与建立一种慢性感染的鸭乙肝实验模型提供良好的线索。     

"911"抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究

目的：评价药物“911”在鸭实验动物模型中抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的效果。方法：北京鸭足静脉注射DHBV，第1次试验随机分为空白，Ara-AMP对照和20，40，80mg/kg3个治疗组，于感染后第7d,给药后第5，10d和停药后第5d采血，第2次试验设空白对照和40．80mg/kg2个治疗组，用药后第5，10d及停药后第5d各组分别处死3只鸭取肝脏检测肝HDBV DNA，采用DOT EIA法检测血清DHBsAg，斑点分子杂交法检测DHBV DNA，Southern转膜杂交检测鸭肝DHBV DNA。结果：第1次试验结果表明，血清DHBsAg及DHBV DNA在20mg/kg组基本无变化，在40mg/kg组治疗后明显下降，但效果无80mg/kg组明显；80mg/kg组DHBsAg 及DHBV DNA水平治疗效果最明显，与用药前及空白对照比较均有统计学意义。第2次试验与第1次试验的结果基本吻合，鸭肝脏DHBV DNA检测表明，80mg/kg治疗组对鸭肝DHBV DNA复制有明显抑制作用。可减少鸭肝DHBV DNA含量。结论：“911”有较好的抗DHBV感染效果，具有明显的剂量反应关系和可重复性。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

鸭乙型肝炎病毒表面抗原的纯化及应用

目的：从鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）感染鸭血清中纯化表面抗原（ＤＨＢsAg),初步应用于病毒感染后复制的研究。方法：用蔗糖密度梯度离心纯化病毒表面抗原,经Bradford法定量血清中该蛋白含量;建立DHBsAgELISA检测方法,并与DHBVDNA斑点杂交相比较。结果：纯化DHBsAg经ELISA检测OD490nm≥1.0,Western杂交显示主要肽分子量为17KDa和35KDa:Bradford法定量血清蛋白含量为2.85-5.10ug/ml,DHBsAgELISA检测100份血清标本阳性数为84例,斑点杂交检测阳性数为88例,两者吻合率为94%。结论：DHBsAg的制备及ELISA方法的建立,为进一步研究病毒感染后复制及体内免疫应答状况奠定了基础。     

Duck hepatitis B virus infection and duck hepatocellular carcinoma.

To study the relationship between duck hepatitis B virus (DHBV) infection and duck hepatocellular carcinoma (DHCC), histological examination and DHBV DNA hybridization were performed in 875 ducks from three flocks in Qidong County. Among them, 34 suffered from hepatoma, including 23 hepatocellular carcinoma, 8 cholangiocarcinoma and 3 hepatocellular-cholangiocarcinoma. Of the 34 ducks with hepatoma 27 were positive for DHBV DNA in the liver and/or serum. DHBV DNA was demonstrated in neoplastic nodules of 22 ducks. Southern blot analysis showed that 13 cases were of the integrated pattern of DHBV DNA in neoplastic nodules. The paratumor tissues of 14 ducks with massive tumor were analysed at the same time. Five cases showed integrated pattern, 4 cases free pattern and the other 4 cases both integration and free pattern of DHBV DNA. The hybridization pattern of DHBV DNA in tumor nodule was different from that in paratumor regions in 11 cases and identical in 3 cases. DHBV antigen was positive in 13 tumor nodules and 21 paratumor tissues in the 34 ducks with hepatic tumor by both victoria blue and orcein stain methods. Advanced liver diseases were found in 30 out of the 34 ducks with hepatoma, including 12 cirrhosis and 18 chronic active hepatitis. In southern blot analysis of 122 DHBV DNA positive Qidong ducks without hepatoma, only free pattern of DHBV was seen, while 44 control ducks from Changchun were negative for DHBV DNA. Neither hepatic tumor nor liver diseases were seen in the control ducks. The results suggest that hepatocellular carcinoma in ducks is similar to that in human HCC. They have a high frequency of viral DNA integrated into the host genome and a liver disease background.