Ad-IL-24抑制乳腺癌生长的体外实验研究

目的 研究腺病毒介导的IL-24基因(Ad-IL-24)表达对乳腺癌的生长抑制作用.方法 将扩增的Ad-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Westernblot法检测IL-24基因在肿瘤细胞中的转录和表达;MTT法和FCM检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制和凋亡率;半定量RT-PCR检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Survivin转录的影响;ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高、Survivin降低有关;VEGF、Ang-1表达下降.结论 腺病毒介导的IL-24基因在体外可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调Survivin、VEGF、Ang-1,上调Bax的基因表达水平有关,该研究可为乳腺癌的基因治疗提供一定实验依据.     

携带Lipocalin 2的溶瘤腺病毒抑制胰腺癌生长的实验研究

 目的 构建携带人Lipocalin 2基因且删除E1B55基因的溶瘤腺病毒,研究其体外对胰腺癌细胞生长的抑制作用。方法 利用RT-PCR技术获得Lipocalin 2基因并克隆至pCA13质粒, 构建pCA13-lipocalin 2。用Bgl II从pCA13-lipocalin 2酶切出包含CMV启动子及Lipocalin 2的表达框, 将该表达框亚克隆入质粒pZD55, 获得pZD55-lipocalin 2。将pZD55-lipocalin 2与pBHGE3共转染293细胞,重组产生携带Lipocalin 2的溶瘤腺病毒ZD55-lipocalin 2。经PCR和Western blot鉴定正确后,体外采用结晶紫染色和MTT法,观察其对胰腺癌细胞生长的抑制作用。结果 ZD55-lipocalin 2能在PANC-1细胞中增殖复制并表达Lipocalin 2蛋白,结晶紫染色和MTT法观察到该溶瘤腺病毒能明显抑制PANC-1细胞生长。结论 成功构建了携带人Lipocalin 2的溶瘤腺病毒,其能明显抑制胰腺癌细胞生长,为胰腺癌治疗提供新策略。     

携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

目的构建携带人lipocalin 2基因且删除E1B55基因的溶瘤腺病毒,研究其体外对胰腺癌细胞生长的抑制作用。方法利用RT-PCR技术获得lipocalin 2基因并克隆至pCA13质粒,构建pCA13-lipocalin 2。用BglⅡ从pCA13-lipocalin 2酶切出包含CMV启动子及lipocalin 2的表达框,将该表达框亚克隆入质粒pZD55,获得pZD55-lipocalin 2。将pZD55-lipocalin 2与pBHGE3共转染293个细胞,重组产生携带lipocalin 2的溶瘤腺病毒ZD55-lipocalin 2。经PCR和Western blot鉴定正确后,体外采用结晶紫染色和MTT法,观察其对胰腺癌细胞生长的抑制作用。结果ZD55-lipocalin 2能在PANC-1细胞中增殖复制并表达lipocalin 2蛋白,结晶紫染色和MTT法观察到该溶瘤腺病毒能明显抑制PANC-1细胞生长。结论成功构建了携带人lipocalin 2的溶瘤腺病毒,其能明显抑制胰腺癌细胞生长,为胰腺癌治疗提供新策略。     

EA-IL-15溶瘤腺病毒的构建及其对胶质瘤细胞特异性及有效性研究

目的 构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15),探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果和特异性。方法 PCR法将EA-IL-15双基因插入腺病毒穿梭载体pXC1,将穿梭质粒pXC1-EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1,3 Cre质粒共转染HEK393细胞,获得溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。通过CCK-8细胞毒性实验,测定细胞相对活性,绘制剂量反应曲线。结果 成功构建溶瘤腺病毒载体(oAD)及含EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒载体(oAD-EA-IL-15);体外包装获得相应的溶瘤腺病毒oAD和oAD-EA-IL-15;oAD对小鼠胶质瘤细胞GL261有明显杀伤作用(P＜0.05),对小胶质细胞BV2(非肿瘤细胞)的杀伤作用明显低于对GL261(P＜0.05),说明oAD具有特异性;oAD-EA-IL-15和oAD分别感染GL261、BV2细胞,对于GL261,oAD-EA-IL-15的半抑制浓度(IC₅₀)值为0.58×10⁷±1.30×10⁵ PFU/ml较oAD的IC₅₀值1.13×10⁷±1.98×10⁵PFU/ml低,对肿瘤细胞的杀伤作用强于oAD(P＜0.01),对于BV2,oAD-EA-IL-15对其活性的影响低于oAD(P＜0.01),说明oAD-EA-IL-15病毒的特异性优于oAD病毒。结论 携带EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒在体外对胶质瘤细胞具有明显的杀伤作用和特异性,可为胶质瘤治疗提供更加特异有效的途径。     

氨氯地平对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭影响的体外实验

目的 探讨氨氯地平对人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231体外侵袭的影响及其相关机制.方法 用8.34 μmol/L氨氯地平处理肿瘤细胞,以人工重组基底膜侵袭小室(Transwell)观察氨氯地平对MDA-MB-231细胞侵袭的影响;免疫细胞化学方法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix met-allo-proteinaae,MMP-9)的表达.结果 8.34 μmol/L的氨氯地平可显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力,侵袭抑制率为36.27%;免疫细胞化学检测结果显示,MMP-9和VEGF蛋白的表达在MDA-MB-231细胞中亦明显降低.结论 氨氯地平对MDA-MB-231细胞体外侵袭具有明显的抑制作用,此作用与降低肿瘤细胞的MMP-9和VEGF的表达有关.     

双调控溶瘤腺病毒携带SEA基因靶向鼠膀胱癌的表达

目的:研究hTERT和HIF启动子双调控的溶瘤腺病毒能否感染鼠膀胱癌细胞并表达治疗基因,为动物实验提供依据.方法:以不同浓度溶瘤腺病毒感染鼠膀胱癌细胞,生物倒置显微镜下动态观察细胞形态变化,RT-PCR检测SEA在细胞内mRNA表达,Western blot检测SEA蛋白表达.结果:镜下可见细胞感染腺病毒并最终裂解,RT-PCR和Western blot分别检测到实验组mRNA和蛋白的表达.结论:携带SEA基因的hTERT/HIF双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制增殖并表达SEA基因,可用于治疗鼠膀胱癌的动物实验研究.     

E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用

目的研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B--OLV)对乳腺癌干细胞的作用。方法E1B--OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组。两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44 CD24-细胞的表型比例。两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44 CD24-细胞的比例。结果实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44 和CD44 CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%。实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44 CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%。结论ElB--OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率。     

特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的研究进展

溶瘤腺病毒因能够杀伤膀胱癌细胞同时对正常组织几乎没有影响而受到人们的广泛关注,对其进行了多方面的研究,其中特异性启动子调控的溶瘤腺病毒是研究热点。人们通过插入单个或多个特异性启动子构建了治疗膀胱癌的组织特异性溶瘤腺病毒来提高其靶向性、特异性和安全性。现就特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的原理、研究进展以及存在的问题等方面进行综述。     

E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用

目的 研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B-- OLV)对乳腺癌干细胞的作用. 方法 E1B- OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组.两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44+CD24-细胞的表型比例.两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44+CD24-细胞的比例. 结果 实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44+和CD44+CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%.实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44+CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%. 结论 ElB-- OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率.     

溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤干细胞的研究进展

肿瘤干细胞(或肿瘤起始细胞)由于具有很强的肿瘤起始能力和浸润转移能力而成为许多肿瘤中难治性的细胞群体。有研究表明肿瘤干细胞对化疗、放疗抵抗,因此与肿瘤的复发有关。针对肿瘤干细胞治疗策略将会影响肿瘤治疗的成败,已有研究表明溶瘤腺病毒可通过感染的方式杀伤肿瘤干细胞,因此可以克服肿瘤干细胞对药物耐受、对放化疗抵抗的机制;另外,通过基因工程的方法在溶瘤腺病毒的构建过程中增加一些外源性抗肿瘤基因,还可促进溶瘤病毒的特异性和抗肿瘤活性。该文总结溶瘤腺病毒靶向针对肿瘤干细胞的研究进展,以期为今后的临床治疗和应用提供理论基础。     

转染人核糖核酸酶抑制因子对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:利用脂质体转染技术上调乳腺癌MDA-MB-231细胞中核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)水平,探讨RI对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染法,将RI基因转入乳腺癌MDA-MB-231细胞,经G418筛选后获得稳定高表达RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI。RT-PCR、Western-blot等方法鉴定RI在转染细胞中的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞术检测细胞周期变化。结果:成功构建了稳定高表达RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI;MTT结果显示,转染的RI基因能抑制细胞恶性增殖(P<0.01);细胞周期分析显示转染的RI基因使细胞停留在G₀/G₁期,S期细胞明显减少(P<0.01)。结论:RI能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的恶性增殖。     

莲心碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬功能的影响

目的 观察莲心碱作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后,自噬表型的变化,初步论证莲心碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬功能的调控作用.方法 透射电子显微镜观察莲心碱处理后MDA-MB-231的亚细胞结构变化,激光共聚焦显微镜观察pEGFP-LC3或ptfLC3(mRFP-EGFP-LC3)转染后自噬小体的形成和自噬流的变化,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B,SQSTM1/p62,Beclin1的表达,以及论证自噬流的变化.结果 透射电镜显示,与对照组比较,莲心碱处理后MDA-MB-231细胞内有较多自噬空泡出现,部分分裂的线粒体,但未见到高密度的嗜锇性的自噬溶酶体结构;EGFP-LC3转染后,莲心碱组自噬体数量显著多于对照组(P＜ 0.01);Western blot检测到自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ,SQSTM1/p62表达呈现量效性和时效性的增多[20 μmol/L组或24 h组与对照组比较(P＜0.01)],Beclin1未见显著变化[20 μmol/L组与对照组比较(P＞0.05)];mRFP-EGFP-LC3转染后,对照组可见少量自噬体和自噬溶酶体,莲心碱和Bafilomycin A1处理组均可见大量自噬体结构,未见显著自噬溶酶体结构;Westem blot证实莲心碱处理后增多的LC3B-Ⅱ不受Bafilomycin A1预处理的影响[莲心碱组LC3B-Ⅱ,SQSTM1/p62蛋白水平与Bafilomycin A1预处理加莲心碱组比较(P＞0.05)].结论 莲心碱抑制自噬小体成熟,阻断乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬降解作用.     

微小核糖核酸101异常表达与乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的关系

目的探讨微小核糖核酸101（miRNA-101）在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达及其对MDAMB-231 细胞增殖的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A 中miRNA-101 的表达。采用Lipofectamine TM 2000 将miRNA-101-mimic/inhibitor/NC 分别转染至MDA-MB-231 细胞中,通过qRT-PCR检测miRNA-101 的转染效率,CCK-8 实验检测MDA-MB-231 细胞的增殖。结果miRNA-101 在MDA-MB-231 细胞中的表达水平低于正常乳腺细胞MCF-10a（ p<0.01）。转染miRNA-101 mimic 后MDA-MB-231 细胞的增殖能力减弱（p <0.05）,而转染miRNA-101 inhibitor后细胞的增殖能力增强（p <0.05）。结论miRNA-101 在乳腺癌细胞MDA-MB-231中低表达,转染miRNA-101 mimic后乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖减弱。     

成骨前体细胞对乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响

目的 通过共培养体系探讨成骨前体细胞MC3T3-E1对MDA-MB-231乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响.方法 实验组将MC3T3-E1及MDA-MB-231细胞采用transwell小室共培养,上室接种MC3T3-E1成骨细胞,下室接种相同数量的MDA-MB-231细胞.对照组上、下室均采用相同数量及密度的MDA-MB-231细胞.实时荧光定量PCR、Western blot法检测实验组及对照组骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的基因及蛋白的表达差异,采用CCK-8法检测各组增殖的差异,结晶紫染色法检测细胞集落形成差异.结果 与对照组相比,实验组OCN、OPN、OPG的基因及蛋白表达均有明显的上调(P＜0.05),MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增高(P＜0.01);实验组MDA-MB-231细胞集落形成数量及大小均优于对照组.结论 短期共培养后MC3T3-E1成骨细胞可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞表达骨拟态特性,并可促进其增殖及细胞集落形成.     

细胞凋亡在人乳腺癌细胞拟态血管形成中的作用

目的:研究细胞凋亡对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)体外形成拟态血管的影响。方法:建立体外人工基底膜三维细胞培养模型,观察乳腺癌细胞能否形成血管样结构。用Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定血管样结构形成过程中细胞凋亡情况;加入caspase抑制剂Z-VAD-FMK和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO后观察其对血管样结构的影响。结果:三维培养24 h时,乳腺癌细胞伸出细长突起,彼此相互连接,形成腔隙样结构;经PAS染色,可见环状PAS阳性图案,表明乳腺癌细胞在体外可以形成拟态血管。细胞三维培养后凋亡细胞数开始增多,8 h达到高峰,此后凋亡细胞数下降,24 h时凋亡细胞数与对照组相比无明显差异。Z-VAD-FMK和Ac-DEVD-CHO均能明显抑制三维培养状态下细胞拟态血管的形成。结论:在体外三维培养条件下,人乳腺癌细胞可形成拟态血管,而细胞凋亡过程是恶性肿瘤细胞拟态血管形成的关键环节之一。     

Rab基因家族在MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达

目的:以表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足分离,在此基础上,鉴定Rab基因家族在胞体和伪足中的差异表达谱?方法:运用Boyden小室技术分离EGF刺激下MDA-MB-231乳腺癌细胞的胞体和伪足,并鉴定Rab基因家族在乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达谱?结果:RAB1A等21个基因在胞体中高表达,RAB7A等16个基因在伪足中高表达,RAB3B等24个基因在胞体和伪足中的表达量大体相等?结论:本研究建立的基于Boyden小室技术的实验方法可以有效分离乳腺癌细胞的胞体和伪足,在此基础上鉴定了一类在EGF趋化刺激下乳腺癌细胞伪足中富集的Rab 基因,从而为进一步深入研究乳腺癌细胞伪足伸展的确切分子机制提供新的思路和研究方向?     

全反式维甲酸及其衍生物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡的影响

目的：研究全反式维甲酸( ATRA)及其衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯( ATPR)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外凋亡的影响。方法不同浓度ATRA及其衍生物ATPR分别处理MDA-MB-231细胞48 h后,Hoechst染色及流式细胞术检测细胞凋亡的变化,RT-PCR检测凋亡蛋白Caspase-3 mRNA水平的变化, Western blot法检测相关凋亡蛋白表达水平的变化。结果与ATRA相比,相同浓度的ATPR能明显促进MDA-MB-231细胞的凋亡,随着浓度的增加,凋亡作用越加显著( P<0．05)。 RT-PCR显示 ATPR作用后Caspase-3 mRNA 水平显著上调( P <0．05)。 Western blot法显示ATPR能下调抗凋亡蛋白Bcl-2、NF-κB、survivin的表达( P<0．05) ,上调促凋亡蛋白Bax、Grim-19、Caspase-3的表达(P<0．05)。结论 ATPR比ATRA更明显地促进人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡。