人γδT细胞TCR分子与结核杆菌多肽抗原特异性结合的证据

目的探讨γδT细胞对结核杆菌抗原(Mtb—Ag)识别的分子机制。方法采集人外周血(PB)，分别经抗TCRγδ-PE和FITC标记的Mtb—Ag及其纯化的不同组分，结核杆菌高分子量蛋白组分(Mtb—HW-Ag)、低分子量多肽组分(Mtb—LW-Ag)或Mtb-Ag峰3单一主肽抗原(Mtb-Ag-Pk3)进行双标记染色，或使用过量Mtb—AS先与细胞预处理，然后再做上述染色，用流式细胞仪检测γδT细胞上结合的抗TCRγδ-PE荧光强度变化。将人外周血PBMC经Mtb—Ag刺激24h后，使用抗TCRγδ-PE和Mtb—Ag-FITC染色，用激光共聚焦显微镜观察γδT细胞表面TCRγδ分子的聚集。结果经流式细胞仪分析，Mtb—Ag及其纯化的Mtb—LW-Ag、Mtb-Ag-Pk3均可与γδT细胞发生特异性直接结合，而且Mtb—Ag可有效阻断抗TCRγδ单抗与γδT细胞的结合。而Mtb—HW-Ag与γδT细胞并无特异性结合效应。经激光共聚焦显微镜观察，Mtb—Ag可显著激活γδT细胞而诱导TCRγδ分子发生功能性聚集化。结论γδT细胞通过其表面的TCRγδ分子可直接结合Mtb—Ag，而Mtb-Ag-Pk3多肽可能是Mtb—Ag发挥其结合效应的有效成分。Mtb—Ag可激活γδT细胞并诱导TCRγδ分子聚集，而可能参与功能性脂筏(raft)的形成。     

可激活人γδT细胞的结核杆菌耐热多肽抗原的初步纯化与活性鉴定

目的：对结核杆菌耐热多肽抗原（Mtb-Ag)的蛋白组成进行定性分析。并观察Mtb-Ag及其纯化组分刺激人外周血γδT细胞和αβT细胞增殖反应的量效关系。方法：用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）定性分析Mtb-Ag 的蛋白组成，并用不同剂量的Mtb-Ag及其纯化组分体外刺激健康人外周血PBMC，培养9d后经流式细胞仪检测细胞表型。结果：Mtb-Ag经FPLC Mono Q离子交换柱分析存在20种蛋白成分，Mtb-Ag在合适刺激剂量时对人γδT细胞发挥优势扩增，当剂量过大则对αβT细胞发挥优势扩增，其分离纯化的含大分子蛋白的蛋白峰Ⅰ随着刺激剂量增加而对αβT细胞的扩增表现显著增强趋势；而其分离的含低分子多肽的蛋白峰Ⅱ随着刺激量增加则对γδT细胞扩增表现显著增强趋势，并且其活性明显高于蛋白峰I，同时其对αβT细胞的扩增效应并不明显，并显著低于Mtb-Ag和蛋白峰I。结论：Mtb-Ag刺激γδT细胞扩增时应选择合适的刺激剂量，其所含的低分子多肽抗原能特异性激活γδT细胞，而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活αβT细胞。     

TCR/CD3介导T细胞活化的信号途径

T淋巴细胞经特异抗原刺激后，由于TCR／CD3的介导作用，使细胞骨架蛋白及核内转录因子活化，并引起细胞形态改变、生长因子分泌、细胞黏附性改变等免疫应答，使细胞发生活化或激活诱导的细胞死亡（Activation—induced cell death，AICD）。T细胞活化需要两种信号，一种是TCR／CD3与抗原提呈细胞（Antigen presenting cells，APCs）表面特异的MHC-抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；另一种是非特异性抗原刺激信号，如：CD2、CD28、CD80、LFA-1（Lymphocyte function associated antigen-1）和ICAM（Intercellular adhesion moleculel）等与各自相应配体结合而产生的协同刺激信号。如果只有TCR／CD3复合物存在，没有协同刺激信号参与，则不能有效地激活T细胞，而可能导致T细胞产生不应性（Anergy），甚至细胞凋亡（Apoptosis）。T细胞特异性抗原或TCR／CD3的特异性抗体可引起T细胞跨膜受体以及膜附近的其它信号分子的活化或抑制，调节T细胞的增殖、分化或凋亡，这个过程涉及一系列下游信号传导和基因表达调控。近几年对TCR／CD3近膜区的信号复合体的形成、相关信号分子的磷酸化、细胞骨架重组、NF—κB活化、以及与多个信号通路密切相关的蛋白分子，如PI-3K和PKCθ等，在信号通路中的作用有了更深刻的了解，本文就这方面的进展作一简要综述。     

神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原诱导的γδT细胞活化及凋亡作用

目的：研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原（Ｍｔｂ）诱导的γδＴ细胞活化及凋亡作用。方法：用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人ＰＢＭＣ，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδＴ细胞。通过ＭＴＴ试验观察神经酰胺、鞘磷脂酰以及神经酰胺合成酶抑制剂ＦｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１对γδＴ细胞的活化作用；ＦＡＣＳ检测其对γδＴ细胞的亡作用。结果：Ｍｔｂ刺激获得的γδＴ细胞可达７３％。磁珠分选后可高达９８％；高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδＴ细胞的增殖。而出现凋亡，ＦｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１则对γδＴ细胞的增殖及凋亡无明显影响。结论：鞘磷脂水解产生的社经酰胺对γδＴ细胞的有致凋亡作用。     

PKC在结核杆菌抗原诱导人γδT细胞凋亡中的作用

采用Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡的方法,分别观察Mtb-Ag(10.0μg/ml)刺激特异性激活的人γδT细胞不同时间凋亡情况,并研究Rottlerin(PKC抑制剂)预处理对Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡的影响。结果显示Mtb-Ag刺激3h、6h、12h、24h均可显著诱导γδT细胞凋亡(P<0.01),凋亡细胞比例在44.21%～51.76%之间;Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡可被Rottlerin(40.0μmol/L)抑制,凋亡抑制率为98.6%。提示PKC途径参与Mtb-Ag激发活化的γδT细胞凋亡过程。     

APC在结核杆菌低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ^＋T细胞中的作用

目的 探讨抗原递呈细胞（APC）在结核杆菌（Mtb)低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ^ T细胞中的作用。方法 用平皿粘附和尼龙毛柱纯化法,从PBMC中分离单核细胞、B淋巴细胞、然后分别与纯化的T细胞共育,在Mtb抗原的刺激下,观察γδ^ T细胞的增殖效应。结果 Mtb低分子多肽抗原在激活γδ^ T细胞时,需要单核细胞、B细胞等APC的存在,但APC并不起摄取、加工、递呈抗原的作用。结论γδ^ Tx细胞具有与γδ^ T细胞不同的独特抗原识别方式。     

结核杆菌抗原诱导的人γδT细胞表达L-选择素的调控机制

采用CD62L生物素-链霉亲和素染色流式细胞术检测L-选择素在细胞表面表达的方法,分别观察新鲜PBMC和刺激后培养3~21 d的γδT细胞表面L-选择素的表达,并研究培养6~7 d的MtbAT预先用LY294002(PI3K途径抑制剂)、SB203580(p38途径抑制剂)、PD98059(MEK抑制剂)分别处理20 min,然后用Mtb-Ag再刺激3 h时γδT细胞表面L-选择素的表达情况。结果显示新鲜PBMC中γδT细胞L-选择素的表达率为(43.9%±6.7%),αβT细胞L-选择素的表达率为(76.6%±7.9%),有显著差异(P<0.05)。用Mtb-Ag激活后培养第6天时L-选择素在γδT细胞的表达达到高峰(90.7%);以后L-选择素表达逐渐下降,15~21 dγδT细胞L-选择素的表达在低水平(16.2%~10.6%)维持;Mtb-Ag再刺激MtbAT诱导γδT细胞L-选择素表达下调为69.5%,预先加入LY294002或PD98059,则L-选择素表达率分别为83.1%和78.7%;而加入SB203580未见明显影响。提示γδT细胞活化时L-选择素表达调控与PI3K、Ras/Erk途径有关,但与p38MAPK途径无关。     

PKC在结核杆菌抗原诱导入γδT细胞凋亡中的作用

采用Annexin—V—FITC／PI染色流式细胞术检测细胞凋亡的方法，分别观察Mtb—Ag（10．0μg／ml）刺激特异性激活的人γδT细胞不同时间凋亡情况，并研究Rottlerin（PKC抑制剂）预处理对Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡的影响。结果显示Mtb-Ag刺激3h、6h、12h、24h均可显著诱导γδT细胞凋亡（P〈0．01），凋亡细胞比例在44．21％-51．76％之间；Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡可被Rotflerin（40．0μmol／L）抑制，凋亡抑制率为98．6％。提示PKC途径参与Mtb-Ag激发活化的γδT细胞凋亡过程。     

结核杆菌抗原活化的γδT细胞中ZAP-70的酪氨酸磷酸化特点

目的　观察结核杆菌抗原 (Mtb Ag)活化的γδT细胞信号转导分子ZAP 70酪氨酸磷酸化的特点。方法　用Mtb Ag和抗CD3单克隆抗体 (CD3McAb)体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC) ,诱导活化 ,在含IL 2的培养液中扩增培养 ,分别获得Mtb Ag激活的T细胞 (MtbAT)和CD3McAb激活的T细胞 (CD3AT)。再分别用Mtb Ag和CD3McAb刺激 ,在不同时间内提取细胞裂解液 ,用抗 酪氨酸磷酸化蛋白抗体作免疫沉淀 ,用抗ZAP 70单克隆抗体进行免疫印迹。结果　MtbAT中γδT细胞可达 6 0 %～ 80 % ,CD3AT中CD3 细胞可达 90 %以上 ,而γδT细胞 <10 % ;MtbAT细胞用Mtb Ag再刺激后 15min时出现ZAP 70的酪氨酸磷酸化 ,30min达高峰 ,可持续到 6 0～ 12 0min ,而CD3AT用CD3McAb再刺激后仅在 5min时检测到ZAP 70的磷酸化。结论　与CD3McAb对普通T细胞的作用比较 ,Mtb Ag刺激可优先活化γδT细胞 ,其对γδT细胞ZAP 70活化的特点是 :较慢、较强、较持久     

刺激人γδ+T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的纯化与活性鉴定

目的：纯化可刺激人γδ^ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原。方法：采用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）S-100分子筛层析柱，对结核杆菌耐热抗原（Mtb-Ag)初步分离，将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原（Mtb-LW-Ag)洗脱峰，分别再经FPLCMonoQ离子交换层析柱进一步纯化，并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ^ T细胞增殖活性的测定。结果：Mtb-Ag经FPLCS-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰（B，C，D），Mr低的多肽峰分别糨MonoQ柱层析，鉴定出B峰含有6个主峰，C峰含有1个主峰，D峰含有8个主峰，对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测，发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ^ T细胞扩增。结论：利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽，而且其中的B-Ⅲ多肽的C-主肽可能是促进γδ^ T细胞活化增殖的主要多肽。     

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ+T细胞的细胞毒活性研究

目的探讨选择性扩增人γδ+T细胞的方法及其细胞毒活性.方法用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)刺激正常人PBMC,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ+T细胞,通过MTT试验观察γδ+T细胞对人红白细胞白血病细胞株K562的细胞毒活性.结果 Mtb刺激及磁珠分选后的γδ+T细胞可达73%和98%,效靶细胞比例为10:1时其对K562细胞的杀伤率分别为59%和78.5%.结论 Mtb刺激及磁珠分选所获得的高纯度γδ+T细胞可介导对K562细胞的高效细胞毒活性.     

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ＋T细胞的细 …

目的 探讨选择性扩增人γδ＋Ｔ细胞的方法及其细胞毒性。方法 用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原（Ｍｔｂ）刺激正常人ＰＢＭＣ，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ＋Ｔ细胞，通过ＭＴＴ试验观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞观察γδ＋Ｔ细胞对人红白细胞白血病细胞株Ｋ５６２的细胞毒活性。结果 Ｍｔｂ刺激及磁珠分选后的γδ＋Ｔ细胞可达７３％和９８％。效靶细胞比例为１０：１时其对Ｋ５６２细胞的杀     

纯化的结核杆菌多肽抗原刺激人γδT细胞的效应分析

目的：探讨从结核杆菌多肽抗原(Mtb-Ag)纯化的多肽(C主肽)对人新鲜外周血γδT细胞的促增殖效应以及对已活化扩增的T细胞再次刺激的激活效应。方法：采用不同剂量的C主肽体外刺激健康人外周血PBMC，培养10天时经流式细胞仪检测细胞表型；另外以γδT细胞活化标志分子CD69的表达为指标，分析C主肽对已被Mtb-Ag激活扩增13天的γδT细胞再次刺激的激活效应。同时以MTT法检测C主肽的再刺激对已活化扩增的γδT细胞的促增殖活性。结果：结核杆菌C主肽对人新鲜的γδT细胞具有显著扩增效应；当C主肽再刺激已经活化的γδT细胞时，可使其显著表达CD69分子，同时对γδT细胞具有显著促增殖活性。结论：结核杆菌C主肽可能是Mtb-Ag发挥特异性激活人γδT细胞的有效成分。     

小鼠血小板/T细胞活化抗原1的表达分布与功能

目的研究小鼠血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ＰＴＡ１）在小鼠组织及各种细胞系的表达分布与诱导,及其在杀伤性Ｔ细胞和ＬＡＫ细胞诱导中的作用。方法应用流式细胞仪技术分析ＰＴＡ１在小鼠组织及细胞系中的表达及诱导;用同种异体抗原诱导杀伤性Ｔ细胞,用ＩＬ－２诱导ＬＡＫ细胞,分别研究ＰＴＡ１特异性单克隆抗体对其分化的影响。结果小鼠ＰＴＡ１主要在Ｔ细胞系呈诱导性表达,参与杀伤性Ｔ细胞的分化,但不参与ＬＡＫ细胞的诱导。结论小鼠ＰＴＡ１与人ＰＴＡ１有相似的分布特点与功能,是一种进化中高度保守的白细胞分化抗原     

APC辅助超抗原活化T细胞的机制

超抗原是ＭＨＣ非限制性及ＴＣＲＶβ特异性方式激活Ｔ细胞的一种新的蛋白质抗原分子。现已发现它所激活的Ｔ细胞可引发人体的多种急、慢性疾病。ＡＰＣ以与辅助普通抗原不同的方式辅助超抗原是超抗原活化Ｔ细胞的关键，了解ＡＰＣ辅助超抗原活化Ｔ细胞的机制有助于理解超抗原激活Ｔ细胞的机理及预防超抗原所引发的疾病。     

结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响

目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）再刺激Mtb-Ag活化的T细胞（Mtb-AT细胞）诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.     

Mtb-Ag活化γδT细胞的扩增及对γδT细胞CD69分子表达的影响

目的 用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)激活和扩增γδT细胞,观察γδT细胞表面CD69分子表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用Mtb-Ag刺激PBMC,所得细胞用磁珠阳性分选,通过荧光单抗TCR γδPE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例.用γδPE/CD69FITC细胞双染检测初次刺激和再次刺激γδT细胞CD69分子的表达情况.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为(4.9±1.85)％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为(69.2±6.57)％,免疫磁珠阳性分选后达(99.3±8.92)％.Mtb-Ag初次刺激γδT细胞,CD69分子的表达24 h达高峰,为75.2％;Mtb-Ag再次刺激γδT细胞,CD69分子的表达6h达高峰,为72％.结论 Mtb-Ag能特异地刺激PBMC中的γδT细胞增殖,Mtb-Ag初次和再次刺激均可特异性活化γδT细胞.