RNA干扰Caspase-3基因抑制大鼠肝脏缺血再灌注损伤

目的 观察RNA干扰(RNAi)Caspase-3基因对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用.方法 构建针对大鼠Caspase-3基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体.肝脏IRI前48 h经门静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)或Caspase-3 shRNA,实验随机分为3组,假手术组、PBS组和shRNA组.阻断大鼠70%入肝血流40 min,再灌注6,12,24 h,3,5,7 d检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平,肝组织Caspase-3 mRNA的表达,细胞凋亡情况,丙二醛(MDA)以及超氧化物歧化酶(SOD)的含量.结果 与PBS组比较,shRNA组再灌注6,12,24 h血清ALT和AST水平显著降低(P<0.05),shRNA组大鼠肝组织的Caspase-3 mRNA水平、肝细胞凋亡指数(25.21%±3.18%vs 35.24%±2.33%,P<0.05)和肝组织中MDA含量[(96.3±12.8)nmol/mg vs(133.5±12.4)nmol/mg,(P<0.05)]显著降低,SOD活性显著升高[(22.5±3.4)U/mg vs(12.2±3.1)U/mg,(P<0.05)].结论 RNA干扰Caspase-3基因可以抑制细胞凋亡的发生,保护肝脏缺血再灌注损伤.     

Caspase-3和Caspase-8基因沉默保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤

目的 观察Caspase-3和Caspase-8基因沉默对大鼠肝脏缺血再灌注损伤((IRI)的保护作用.方法 分别构建针对大鼠caspase-3和caspase-8基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体.肝脏IRI前48 h经门静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)、空载体或Caspase-3和Caspase-8shRNA,实验随机分为4组,假手术组、PBS组、空载体组和shRNA组.阻断大鼠70%入肝血流40min,再灌注6、12、24 h、3、5、7 d检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平,肝组织Caspase-3和Cmpase-8 mRNA的表达,Caspase-3和Caspase-8蛋白活性,细胞凋亡情况,丙二醛(MDA)以及超氧化物岐化酶(SOD)的含量.结果 与PBS组和空载体组比较,shRNA组再灌注6、12、24 h、3、5 d血清ALT和AST水平显著降低(P＜0.05),Caspase-3和Caspase-8 mRNA水平、Caspase-3和caspase-8蛋白活性(Cmpme-3活性:0.18±0.03比0.36±0.03和0.38±0.02,P＜0.05;caspase-8活性:0.16±0.03比0.32±0.02和0.34±0.03,P＜0.05)、肝细胞凋亡指数[(22.46±3.25)%比(35.24±2.33)%和(37.36±2.51)%,P＜0.05]和肝组织中MDA含量[(76.2±15.3)比(123.5±12.4)、(136.7±13.6)nmol/mg,P＜0.05)显著降低,SOD活性显著升高[(24.1±3.2)比(12.2±3.1)、(11.4±2.9)U/mg,P＜0.05].结论 Caspase-3和Caspase-8基因沉默可以抑制细胞凋亡的发生,从而起到保护肝脏IRI的作用.     

bcl-2高表达提高肾小管上皮细胞抗凋亡能力的研究

目的 观察凋亡相关基因bcl-2高表达抑制过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用.方法 构建含有人bcl-2 cDNA的逆转录病毒真核表达载体PLXSN,脂质体法将重组质粒转染PA317细胞,G418筛选阳性克隆,鉴定后浓缩收集病毒上清,浓缩病毒液,感染人肾小管上皮细胞株HK-2,Western blot检测bcl-2 mRNA表达.5 mmol/L过氧化氢(HO2)诱导细胞凋亡后,流式细胞仪检测细胞凋亡发生变化.结果 流式细胞仪分析显示5 mmol/L H2O2:成功诱导肾小管上皮细胞凋亡,bel-2逆转录病毒感染肾小管上皮细胞后,bcl-2蛋白水平呈高表达,HK bcl-2组细胞凋亡数量(12.41±3.46)较HK-2组(19.62±4.20)显著减少(P<0.05).而转染空载体的对照组无明显变化(19.62±4.20,P<0.05).结论 bel-2蛋白高表达显著抑制氧化剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡.     

δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肝细胞凋亡及肝组织bcl-2和caspase-3表达的影响

目的 观察δ阿片受体激动剂D-丙2 ,D-亮5脑啡肽(D-Ala2 ,D-Leu5-enkephali,DADLE)对脓毒症大鼠肝细胞凋亡及肝组织bcl-2和caspase-3表达的影响,探讨DADLE对肝脏保护作用的可能机理.方法 采用盲肠结扎加穿孔(CLP)法制作大鼠脓毒症模型,SD大鼠54只(雌雄不限),采用随机数字表法随机分为CLP组(n=18)、DADLE组(n=18)和假手术组(n=18).在不同时间点(2、4及6 h)处死大鼠,原位末端标记法检测肝细胞凋亡情况,免疫组化法检测肝组织中bcl-2及caspase-3蛋白表达的动态变化并观察肝脏的病理改变.结果 CLP组大鼠肝组织病理损害明显较假手术组严重,DADLE组肝脏的病理变化明显改善; CLP组大鼠肝组织细胞凋亡指数明显较假手术组升高(P＜0.01),以4 h最显著(P＜0.01),DADLE 组各时相肝细胞凋亡指数均明显降低(P＜0.01); CLP组大鼠肝组织caspase-3蛋白的表达强度比假手术组明显增强(P＜0.01),而bcl-2蛋白的表达则明显减弱(P＜0.05); DADLE组肝组织caspase-3蛋白的表达强度较CLP组明显减弱(P＜0.01),而bcl-2蛋白的表达则明显增强(P＜0.05).肝组织caspase-3的表达与肝细胞凋亡指数呈正相关(r=0.83,P＜0.01),bcl-2的表达与肝细胞凋亡指数呈负相关(r=-0.65,P＜0.01).结论 DADLE能明显改善脓毒症大鼠肝脏的病理变化,其作用机理可能与DADLE下调caspase-3表达、上调bcl-2表达,从而抑制肝细胞凋亡有关.     

三七总皂苷对大鼠肝移植物细胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3 表达的影响

目的探讨三七总皂苷(PNS)预处理对大鼠供肝缺血一再灌注损伤的保护作用及其对供肝细胞凋亡和Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达的影响。方法雄性SD大鼠分别用作供、受体．采用Kamada’s袖套法建立原位肝移植模型，根据供肝切取前1h是否静脉注射PNS(50mg／kg)将大鼠随机分为PNS预处理组(PNS组)和生理盐水对照组(NS组)；另设假手术作对照组(SO组)。分别于供肝再灌注后2h、6h及24h处死各组动物，检测血清ALT及AST，HE切片作病理组织学检查，TUNEL法检测肝细胞凋亡，RT-PCR法检测Bcl-2及Caspas-3m R-NA的表达。结果供肝再灌注后2h、6h及24h各时点，PNS组大鼠血清ALT和AST水平及肝细胞凋亡指数(A1)均明显低于NS组(P＜O．05．P＜O．01)；6h及24h，PNS组大鼠肝组织Bcl-2mRNA的表达水平明显高于NS组(P＜O．05)；2h及6h，PNS组大鼠肝组织Caspase-3mRNA的表达水平明显低于NS组(P＜O．05)。结论PNS预处理大鼠供肝，可以有效地减轻移植肝的缺血／再灌注损伤和细胞凋亡，影响细胞凋亡调控基因Bcl-2和Caspase-3的表达。这可能为PNS抗细胞凋亡的机理之一。     

西维来司钠对重症急性胰腺炎大鼠肝细胞凋亡及B-淋巴细胞/白血病-2/bax表达的影响

目的 观察西维来司钠(Sivelestat)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肝细胞凋亡及B-淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)/bax基因表达的影响,并探讨其机制.方法 健康雄性SD大鼠54只,随机分为C组(对照组)、P组(SAP组)、S组(SAP+ Sivelestat治疗组),每组18只.C组为假手术组,P组大鼠以4％牛黄胆酸钠胆胰管逆行注射制造重症急性胰腺炎模型,S组造模后立即给予Sivelestat [0.2mg/(kg·h)]尾静脉注射治疗.3组大鼠术后3、6、12h分别取6只检测血清中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)含量;取肝组织测定丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量;原位末端标记(TUNEL)法检测造模后大鼠肝细胞凋亡并计算凋亡指数(AI);流式细胞术方法测定肝细胞凋亡率;Western blot法检测造模后12 h bcl-2/bax基因表达.结果 与C组比较,各时点P组大鼠血清NE含量[(5.62±1.70)、(6.83±2.01)、(10.88±3.72) μg/L]、肝细胞凋亡指数(11.4±1.1、15.3±1.1、21.3±1.2)及细胞凋亡率均明显升高;肝组织内MDA含量升高[(9.13±1.32)、(11.62±3.71)、( 13.57±3.29) nmol/mg],SOD含量下降[(154.00±22.38)、(138.05±29.48)、(122.63±28.71) U/mg];肝组织bcl-2表达减少,bax表达增多.与P组比较,各时点S组大鼠血清NE含量[(3.57±2.30)、(4.11±2.16)、(6.66±2.69) μg/L]、肝细胞凋亡指数(8.1±0.7、11.2±0.8、15.1±1.0)及细胞凋亡率均有明显降低;肝组织内MDA含量降低[(5.75±0.86)、(7.95 ±3.01)、(9.77±3.45) nmol/mg]而SOD含量升高[(187.12±37.39)、(179.23±44.59)、( 163.55±25.79) U/mg];肝组织bcl-2表达增多而bax表达下降.结论 西维来司钠可抑制SAP大鼠肝细胞凋亡,具体机制可能与其拮抗NE及氧自由基从而提高bel-2/bax比值有关.     

热休克蛋白70对大鼠离体心脏细胞凋亡的影响

目的 观察热休克蛋白70(HSP70)对离体大鼠供心心肌细胞凋亡相关蛋白bcl-2、bax表达的影响.方法 Wistar大鼠18只,分为2组:对照组(C,n=9),腹腔注射生理盐水0.5 ml,24 h后取离体心脏灌注HTK心脏保护液,4 ℃保存3 h后建立Langendorff离体心脏灌注模型,灌注KH液2 h;实验组(E,n=9)腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1 μmol/kg(0.53 mg/kg),腹腔注射24 h后取离体心脏,处理方法旧C组.运用免疫组织化学SP法测定心肌HSP70含量、bcl-2、bax蛋白的含量并做统计学处理比较.结果 HSPT0含量E组(17.78±1.82)较C组(5.22±1.05)明显增高(P＜0.01),bel-2的表达E组(41.88±5.09)较C组(31.36±3.27)明显增多(P＜0.01),bax的表达E组(22.61±3.49)较C组(40.52±4.17)明显减少(P＜0.01),bel-2/bax比值E组(1.86±0.11)较C组(0.77±0.01)明显增高(P＜0.05).结论 心肌HSP70高表达能促进心肌抗凋亡蛋白bcl-2的表达,减少促凋亡蛋白bax表达,增加bel-2/bax比率,抑制心肌细胞凋亡.     

转染血红素氧合酶-1基因减轻大鼠脂肪肝移植后的缺血再灌注损伤

目的 探讨转染血红素氧合酶-1(HO-1)基因对大鼠脂肪肝移植后缺血再灌注损伤的影响.方法 利用分子生物学方法构建携带有HO-1基因的重组腺病毒(Ad5-HO-1),于供肝切取前48 h经阴茎背静脉将Ad5-HO-1注入供者体内,供肝置于4℃HTK液保存2 h,然后移植.对照组接受正常肝移植;轻度对照组接受轻度脂肪肝移植;轻度实验组接受注射Ad5～HO-1的轻度脂肪肝移植;重度对照组接受重度脂肪肝移植;重度实验组接受注射Ad5-HO-1的重度脂肪肝移植.术后观察各组大鼠的存活率及肝功能;观察移植肝组织的病理变化;测定移植肝组织中HO-1的活性以及HO-1、Bcl-2、锌指蛋白A20、凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)的表达.结果 与重度对照组相比较,重度实验组的丙氨酸转氨酶水平显著下降(P＜0.05).轻度实验组和重度实验组的HO-1活性分别高于各自的对照组(P＜0.05).重度实验组移植肝组织中HO-1、Bcl-2及锌指蛋白A20的表达水平明显高于重度对照组(P＜0.05),而Caspase-3的表达是降低的(P＜0.05).重度实验组的1、7、21 d存活率分别为66.7%(4/6)、50%(3/6)和50%(3/6),而重度对照组的1、7、21 d存活率分别为33.3%(2/6)、16.7%(1/6)和16.7%(1/6),二者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转染血HO-1基因可减轻大鼠脂肪肝移植后的缺血再灌注损伤.     

大鼠胰岛转染人血红素氧合酶-1基因对同种胰岛移植的影响

目的探讨大鼠胰岛转染人血红素氧合酶-1(HO-1)基因在胰岛移植中的潜在应用价值。方法采用携带人HO-1基因的腺病毒对新分离的SD大鼠胰岛细胞进行转染;对体外培养的胰岛细胞使用重组人肿瘤坏死因子α及放线菌酮诱导凋亡。使用流式细胞术检测凋亡率;每只链脲霉素诱导的糖尿病模型大鼠门静脉内置入约1200个胰岛当量的胰岛后,观察糖尿病大鼠血糖及体重变化;免疫组织化学法检测肝内移植胰岛细胞的胰岛素、HO-1蛋白表达及表达CD3抗原的淋巴细胞浸润情况。结果转染人HO-1基因的胰岛细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05);单纯胰岛细胞移植后移植物存活时间为(5.33±4.18)d,转染人HO-1基因的胰岛细胞移植后移植物存活时间为(10.56±4.33)d,两组比较,P<0.05;转染人HO-1基因的胰岛细胞培养48 h即见人HO-1蛋白表达;肝内移植7 d后移植物有人HO-1蛋白表达;移植胰岛周边及胰岛内淋巴细胞浸润程度较单纯胰岛移植组明显减轻。结论大鼠胰岛转染人HO-1基因能够增加体外培养胰岛细胞的抗凋亡能力,并能延长体内移植胰岛的存活时间,减轻淋巴细胞对胰岛的浸润。     

靶向bcl-2基因StealthTM RNA干扰诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 应用RNA干扰技术,构建靶向bcl-2基因StealthTM RNA,转染入人肝癌细胞株,探讨RNA干扰诱导人肝癌细胞凋亡的机制.方法 确定并合成3对人肝癌bcl-2基因干扰序列;脂质体法转染入肝癌细胞株内;荧光显微镜下观察转染细胞并计算转染率;倒置显微镜下观察转染前后细胞形态学的改变;SP免疫细胞化学技术检测StealthTM RNA处理前后细胞bcl-2蛋白表达变化;流式细胞术检测StealthTM RNA干扰对癌细胞凋亡和周期的影响.结果 各组转染成功,荧光镜下显清晰的绿色荧光;各转染组转染率与时间有关,各组48 h的转染率最高(P＜0.01);转染组间StealthTM RNA Ⅰ组的转染效率最高(P＜0.01);倒置显微镜下观察见转染后见部分细胞边缘圆,折光度降低,细胞增殖减慢且易脱落;未转染组细胞呈上皮性贴壁生长,生长旺盛.免疫细胞化学显示,StealthTM RNA干扰后各转染组发现细胞的bcl-2表达减弱,与未转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞术结果示,各转染组细胞凋亡率明显升高,并出现凋亡峰,StealthTM RNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的凋亡率分别为(27.87±4.51)%、(24.50±0.89)%和(26.03±0.57)%,与未转染组细胞凋亡率(3.20±1.71)%,差异有统计学意义(P＜0.01).各转染组细胞发生显著的细胞周期阻滞,表现为S期细胞明显减少,G0/G1细胞明显增多.结论 靶向bcl-2基因StealthTM RNA成功的转染人肝癌细胞中,bel-2蛋白表达受抑制,并明显的诱导癌细胞发生凋亡.     

抑制Caspase-8基因表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用

目的 观察抑制半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8(Caspase-8)基因的表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用.方法 构建针对大鼠Caspase-8基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体.将Lewis大鼠随机分为3组,每组8只.(1)假手术组:麻醉后,取腹部正中切口,缝合关腹;(2)磷酸盐缓冲液(PBS液)组:阻断肝门血流前48 h经门静脉注射PBS液1 ml,然后行肝脏缺血再灌注;(3)shRNA组:阻断肝门血流前48 h经门静脉注射Caspase-8 shRNA 50 μg(总体积为1 ml),然后行肝脏缺血再灌注.肝脏缺血再灌注的方法为阻断大鼠70%入肝血流40min.于再灌注6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d时检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平;检测肝组织中Caspase-8 mRNA的表达、细胞凋亡情况、丙二醛(MDA)以及超氧化物岐化酶(SOD)的含量.结果 与PBS液组比较,shRNA组再灌注6、12、24 h,血清中ALT和AST水平显著降低(P<0.05);肝组织中Caspase-8 mRNA水平、肝细胞凋亡指数(shRNA组和PBS液组分别为22.33%±4.28%和35.24%±2.33%)以及肝组织中MDA含量[shRNA组和PBS液组分别为(94.5±11.2)nmol/mg和(133.5±12.4)nmol/mg]均显著降低(P<0.05),而肝组织中SOD活性显著升高[shRNA组和PBS液组分别为(21.6±3.7)U/mg和(12.2±3.1)U/mg,P<0.05].结论 通过RNA干扰Caspase-8基因的表达可以抑制肝细胞凋亡的发生,减轻肝脏缺血再灌注损伤.     

前列地尔对兔肾缺血再灌注时细胞凋亡的保护作用

目的 观察前列地尔对兔肾缺血再灌注损伤时肾小管上皮细胞凋亡的保护作用.方法 建立兔肾缺血再灌注损伤动物模型,将实验兔随机分为3组:即对照组、缺血再灌注组和前列地尔组,每组10只.检测兔血清肌苷(Cr)、尿素氮(BUN)浓度及肾组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)含量及肾组织中凋亡细胞.结果 与对照组比较,缺血再灌注组和前列地尔组在再灌注后Cr、BUN水平均大幅度上升(P＜0.05);但前列地尔组动物在再灌注60min后Cr水平(231.32±17.57)μmol/L明显低于缺血再灌注组(390.61±20.42)μmol/L(P＜0.05);肾小管上皮细胞bcl-2、bax、Caspase-3表达与对照组比较,缺血再灌注组明显增强(P＜0.05);前列地尔组与缺血再灌注组比较表达减弱,但仍强于对照组(P＜0.05).前列地尔组、缺血再灌注组与对照组比较凋亡细胞数增多,前列地尔组与缺血再灌注组比较凋亡细胞数减少.MDA、SOD与MPO的活性与对照组比较,缺血再灌注组与前列地尔组明显增强(P＜0.05);前列地尔组与缺血再灌注组比较,该两者活性明显减弱(P＜0.05).结论 前列地尔在肾脏缺血再灌注损伤时能有效的保护肾功能其作用机制可能是通过减少细胞脂质过氧化,从而降低bcl-2、bax、Caspase-3等凋亡基因的表达.

Abstract：

Objective To study the alprostadil effects of alprostadil on apoptosis by renal ischemia-reperfusion injury (IR[) in rabbits. Methods The rabbit IRI models were made, and randourly divided into three groups: control group, IR[group and prostavasin intervention group. The creatinine (Ct) and blood urea nitrogen (BUN) were determined. Malondialdehyde ( MDA), superoxide dismutase (SOD),myeloperoxidase ( MPO), bcl-2, bax, Caspase-3 and apoptosis were assayed at 60 min after reperfusion.Results The Cr and BUN levels in plasma in IRI group and Prostavasin intervention group were increased obviously after reperfusion. The Cr levels at 60 min after repeffusion in alprostadil intervention group (231.32 + 17. 57 ) μmol/L were significantly lower than in IRI group ( 390. 61 ± 20. 42 ) μ mol/L, ( P ＜0. 05 ). The levels of bcl-2, bax, Caspase-3 in the renal tissue in IRI group were significantly higher than in control group ( P ＜ 0. 05 ), and those in alprostadil intervention group were lower than in IRI group, but markedly higher than in control group (P ＜ 0. 05 ). The number of apoptotic cells in alprostadil intervention group and IRI group was increased as compared with control group, and that in alprostadil intervention group was reduced as compared with IRI group. The contents of MDA, SOD and MPO in renal tissue of IRI group and Prostavasin intervention group were significantly higher than in control group ( P ＜ 0. 05 ), and those in IRI group were significantly lower than in alprostadil intervention group (P ＜0. 05 ). Conclusion Alprostadil could be used to protect renal ischemia-reperfusion injury probably by decreasing oxygen free radicals generation, inhibiting neutrophils aggregating and activating in the renal tissues, thereby inhibiting the expression of bcl-2, bax, Caspase-3.     

磷酸甘油酸变位酶5调控细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用

目的  研究磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)调控细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤(IRI)中的作用及分子机制。方法  建立C57小鼠肝脏IRI模型,随机分别予再灌注6 h(6 h组)与12 h(12 h组),并设立假手术组(Sham组),每组10只。分析IRI对小鼠肝组织及血清学指标的影响; 分析小鼠肝脏IRI过程中PGAM5、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1的表达情况。建立肝细胞IRI模型(IRI组),采用Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK预处理后再建立肝细胞IRI模型(抑制剂组),将未处理的AML12细胞作为对照组,分析抑制Caspase-1活性对细胞焦亡的影响。采用脂质体3000将PGAM5小干扰核糖核酸(siRNA)(siRNA组)和siRNA阴性对照(siRNA-NC)(siRNA-NC组)转染至AML12细胞,再建立肝细胞IRI模型,将未处理的AML12细胞作为对照组,分析PGAM5调控细胞焦亡对肝细胞IRI的影响。结果  6 h组和12 h组小鼠肝组织中部分肝细胞水肿,肝窦区变窄,中央静脉充血,偶见点灶状坏死等,且12 h组较6 h组病变加重。与Sham组小鼠比较,6 h组和12 h组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平升高,且12 h组高于6 h组; 6 h组和12 h组肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平升高,12 h组低于6 h组; 6 h组和12 h组小鼠肝组织IL-1β信使核糖核酸(mRNA)相对表达量升高,12 h组低于6 h组; 6 h组和12 h组肝组织细胞凋亡率升高,12 h组低于6 h组(P < 0.01~0.05)。与Sham组小鼠比较,6 h组和12 h组小鼠肝组织PGAM5 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均升高,且12 h组高于6 h组(P < 0.01~0.05);6 h组和12 h组肝组织PGAM5、Caspase-1蛋白表达增多。IRI组细胞NOD样受体蛋白3(NLRP3)、裂解Caspase (cleaved Caspase)-1及Gasdermin D(GSDMD)蛋白相对表达量较对照组升高,GSDMD荧光强度较对照组增强; 抑制剂组NLRP3、cleaved Caspase-1及GSDMD蛋白相对表达量较IRI组下降,GSDMD荧光强度较IRI组减弱(P < 0.01~0.05)。与对照组比较,siRNA-NC组细胞存活率下降,PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量升高(P < 0.01~0.05);与siRNA-NC组比较,siRNA组细胞存活率升高,PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量下降(P < 0.01~0.05)。结论  PGAM5可加重小鼠肝脏IRI,其机制可能为通过PGAM5/Caspase-1/GSDMD信号通路调控细胞焦亡,加速肝细胞损伤。     

热休克蛋白70-2基因沉默诱导大鼠精原细胞凋亡及其机制

目的 探讨热休克蛋白(HSP)70-2基因沉默对精原细胞的影响及其机制.方法 构建HSP70-2特异的短发夹RNA(shRNA)质粒载体,并转染大鼠精原细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSP70-2 mRNA表达,Western blot检测HSP70-2、Cyclin DI、bcl-2和box蛋白表达,应用流式细胞术分析细胞周期和凋亡.结果 HSP70-2基因沉默组的HSP70-2蛋白表达量为0.93±0.13,明显低于阴性对照组1.31±0.10(P<0.01);流式细胞术检测结果显示,与转染Scrambled的阴性对照组比较,转染pGenesil-1-HSP70-2重组质粒组的PC3细胞在G1期出现明显细胞周期阻滞和细胞凋亡,G1期阻滞细胞比例为(80.09±2.37)%,凋亡率为(7.44±2.41)%,而阴性对照组分别为(61.85±2.31)%和(1.09±0.57)%(P<0.05).与阴性对照组比较,转染后细胞bcl-2、Cyclin D1表达水平显著降低,而bax表达水平升高.结论 HSP70-2基因沉默能诱导精原细胞凋亡,其机制可能是通过Cyclin D1蛋白调节细胞周期并通过上调box蛋白表达促进细胞凋亡.     

β-arrestin-2通过上调PI3K/Akt信号抑制自噬以减轻小鼠肝脏缺血-再灌注损伤

目的  验证β-arrestin-2是否通过上调PI3K/Akt信号抑制自噬对小鼠肝脏缺血-再灌注损伤（IRI）发挥保护作用。方法  将C57BL/6背景的β-arrestin-2基因敲除（KO）及野生型（WT）小鼠各12只,随机分为KO小鼠假手术组（KO+sham组）,KO小鼠IRI组（KO+IRI组）,WT小鼠假手术组（WT+sham组）和WT小鼠IRI组（WT+IRI组）,每组各6只。分别建立70%肝脏IRI模型或进行假手术处理,于肝脏再灌注或手术后6 h进行相关研究。采用免疫组织化学（免疫组化）染色检测凋亡信号蛋白裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、增殖信号蛋白Ki-67及PI3K/Akt通路信号蛋白p-Akt的表达。结果  免疫组化染色结果显示,与相应的sham组比较,KO+IRI组和WT+IRI组小鼠肝组织中的cleaved Caspase-3、Ki-67和p-Akt阳性细胞计数均增加（均为P < 0.01）;与WT+IRI组比较,KO+IRI组小鼠肝组织中cleaved Caspase-3阳性细胞计数增加,Ki-67和p-Akt阳性细胞计数均减少（均为P < 0.05）。结论  β-arrestin-2可减轻小鼠IRI后肝细胞凋亡、促进其损伤修复,其通过上调PI3K/Akt信号抑制自噬来减轻小鼠肝脏IRI。     

左卡尼汀对肾缺血再灌注损伤的抗氧化作用及其机制

目的研究左卡尼汀对大鼠肾缺血再灌注损伤的抗氧化作用并探讨其机制。方法将大鼠随机分为3组：对照组（C组）,缺血再灌注组（IR组）,左卡尼汀组（LC组）。C组不予缺血再灌注处理,IR组及LC组建立肾脏IR模型。再灌注6h后检测各组血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平;测定肾组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量;RT-PCR检测肾组织核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧化酶-1（HO-1）mRNA含量;Western-blot检测各组肾组织Nrf2及HO-1蛋白表达水平。结果 LC组血清Cr、BUN水平低于IR组[（74.17±12.80）μmol/L、（24.28±2.58）mmol/L vs.（112.83±17.45）μmol/L、（35.13±6.01）mmol/L],差异具有统计学意义（P〈0.01）。LC组肾组织SOD活性高于IR组[（39.55±6.61）kU/g vs.（28.05±4.37）kU/g],差异具有统计学意义（P〈0.01）;MDA显著降低于IR组[（4.15±0.69）μmol/g vs.（6.12±1.08）μmol/g],差异具有统计学意义（P〈0.01）。IR组Nrf2、HO-1mRNA及蛋白表达水平高于C组（P〈0.01）,低于LC组（P〈0.01）。结论左卡尼汀对肾脏缺血再灌注损伤具有明显保护作用,其机制可能为激活Keapl-Nrf2-ARE通路进而诱导HO-1的表达。     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

HMGB1/Caspase-1/GSDMD信号轴介导肝细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用

目的  探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1/Gasdermin D（GSDMD）信号轴介导肝细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤（IRI）中的作用。方法  将C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）、IRI 2 h组、IRI 6 h组、IRI 12 h组、甘草酸（GA）+Sham组和GA+IRI 12 h组（每组8只）;将AML12细胞大致均匀地分为Sham组、IRI 12 h组、GA+Sham组和GA+IRI 12 h组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的水平;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织中IL-1β和IL-6信使核糖核酸（mRNA）水平;比较各组小鼠肝脏缺血病理学评分和细胞凋亡情况;采用免疫组织化学（免疫组化）法检测各组小鼠肝组织中HMGB1的表达情况;采用蛋白质印迹法检测小鼠肝组织和AML12细胞中HMGB1、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平。结果  与Sham组比较,IRI后各组小鼠血清中ALT、AST、IL-1β、IL-6水平,以及小鼠肝组织中的IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高（均为P < 0.05）,且随着再灌注时间的延长呈明显的时间依赖性。与Sham组比较,IRI后各组小鼠肝脏缺血病理学评分和肝细胞凋亡率均升高（均为P < 0.05）。免疫组化结果显示,IRI后HMGB1在肝组织中的表达明显增多,且在2~12 h内随着时间延长而增多。蛋白质印迹法结果显示,在体内和在体外,与Sham组比较,IRI 12 h组HMGB1、Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量均升高;与IRI 12 h组比较,GA+IRI 12 h组HMGB1蛋白相对表达量升高,Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量均降低,差异均有统计学意义（均为P < 0.05）。结论  肝细胞可能通过释放HMGB1激活Caspase-1/GSDMD通路,从而触发肝细胞发生焦亡,导致肝脏IRI,而通过GA抑制HMGB1的胞外释放可减轻肝脏IRI。     

5-氟尿嘧啶诱导直肠癌HR8348细胞凋亡作用的研究

目的　探讨 5 氟尿嘧啶 (5 fluorouracil ,5 FU )体外诱导直肠癌HR83 48细胞凋亡的作用及细胞凋亡与bcl 2、bcl xl、bax及 p5 3表达的关系。 方法　经 5 FU处理HR83 48细胞 2 4h后 ,用甲基绿 派若宁染色法和TUNEL法检测细胞凋亡情况 ,并用SP免疫组织化学法检测HR83 48细胞中bcl 2、bcl xl、bax和 p5 3的表达。 结果　HR83 48细胞经 5 FU作用 2 4h后 ,细胞凋亡指数 (AI)明显高于对照组 ,差异有显著性意义 (P<0 .0 1)。 5 FU作用不同时相bcl 2的表达评分结果与对照组比较差异均无显著性意义 ;不同时相bcl xl的表达评分结果与对照组比较稍降低 ;而bax的表达评分结果随时间延长明显增加 ,2 4h、3 6h的表达评分结果明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,而 p5 3在 5 FU组和对照组各时相均未见表达。结论　 5 FU具有诱导HR83 48细胞凋亡的作用 ;5 FU可能通过上调bax的表达并改变bax/bcl xl的比值而诱导HR83 48细胞凋亡。