高端流式分选与免疫磁珠法纯化T细胞的比较

目的 为建立一种高效、高活性的T细胞的分离纯化方法,分别采用流式细胞分选技术(FACS)及免疫磁珠分选技术(MACS)从小鼠脾脏组织分离纯化CD8+T细胞.方法 通过测定分选后细胞的纯度、回收率、细胞活力、实验耗时及细胞学形态等指标,综合全面地比较了上述两种纯化方法分离CD8+T细胞的差异.结果 流式细胞分选仪分选后CD8+T细胞纯度为(99.5±0.00)％,而免疫磁珠法的纯度为(95.6±0.25)％.流式细胞分选仪分选CD8+T细胞的回收率为(74.33±3.28)％,而免疫磁珠法的回收率为(60.00±1.53)％.流式细胞分选法耗时1.5 h,免疫磁珠法则需要2.5 h.流式细胞分选后的细胞活力要比免疫磁珠法收集的要高.经流式分选后得到的细胞在12h时就开始出现集落生长,24 h时生长最佳,而经免疫磁珠分选后的细胞总体生长趋势较流式分选后的细胞缓慢.结论 流式细胞分选法较免疫磁珠法效率更高,能得到更高活性的细胞.     

CD4＋T淋巴细胞分选方法的效果评价

目的 建立一种准确且对细胞活性影响小的分离人外周血CD4＋T细胞的分选方法.方法 对人外周血依次采用密度梯度离心（density gradient centrifugation,DGC）和免疫磁珠分选（magnetic-activated cell sorting,MACS）进行CD4＋T细胞分选.分选后的细胞用流式细胞仪（flow cytometry,FCM）、倒置显微镜及细胞周期分析进行分选纯度和生长状态检测.结果 Percoll密度梯度离心法收集的单个核细胞中CD4＋T细胞纯度为（38.8±2.7）％,免疫磁珠分选后CD4＋T细胞纯度为（96.2±0.7）％,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）,且分选后细胞形态及功能完好,24 h内活性最高.结论 密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合可以有效提高CD4＋T细胞的分选纯度及保持其活性,可继续用于相关功能研究.     

调节性T细胞及其与移植免疫和肿瘤免疫的研究进展

一、调节性T细胞的概述1.调节性T细胞的来源和分类20世纪70年代初期,Gershon等发现,T淋巴细胞种群中有一类细胞亚群具有抑制其他T淋巴细胞亚群功能的特性,但并不清楚这一特殊的细胞亚群[1]。1995年Sakaguchi等研究发现在小鼠和人类的外周血中存在有5%~10%的CD4+T细胞持续较高水平表达CD25分子[白细胞介素(IL)—2受体α链],去掉这部分细胞的裸鼠则容易患上自身免疫性疾病,然而将这部分细胞重新回输     

反复自然流产患者免疫治疗后封闭抗体与调节性T淋巴细胞变化

目的:通过研究反复自然流产(RSA)患者主动免疫治疗前后外周血中封闭抗体(BA)和调节性T淋巴细胞(Tr)变化和治疗后的妊娠结局,探讨BA、Tr与RSA发病的关系,评价主动免疫治疗对于RSA的疗效.方法:采用酶联免疫法(ELISA)检测BA;双荧光标记流式细胞分析技术检测80例RSA患者外周血CD+4CD+25Tr及CD+4CDhigh25T的表达率.结果:经免疫治疗后,流产组患者外周血中出现BA,阳性率为92.50%;CD+4CD+25Tr及CD+4CDhigh25T 的表达率明显低于正常妊娠组和正常非妊娠妇女;免疫治疗后,流产组患者外周血CD+4CD+25Tr及CD+4CDhigh25T的表达率较治疗前明显增加;再次妊娠的成功率为86.67%.结论:RSA的发生可能与患者外周血中BA水平、CD+4CD+25Tr和CD+4CDhigh25T数量减少有关;主动免疫治疗可以提高BA的阳性率,增加CD+4CD+25Tr数量,提高再次妊娠的成功率,是治疗RSA的一种有效方法.     

阿尔茨海默病的调节性T细胞功能检测

目的对阿尔茨海默病（AD）患者外周血调节性T细胞功能进行研究。方法流式细胞仪测定T细胞亚群；细胞分选仪分离调节性T细胞，体外培养行淋巴细胞混合培养法检测调节性T细胞对同源／异源淋巴细胞增殖的抑制效应；ELISA法检测调节性T细胞细胞因子肿瘤坏死因子-β、白细胞介素-10的分泌水平。结果CD4^＋CD25^＋调节性T细胞细胞比例和健康对照组相比差异无显著性。肿瘤坏死因子-β、白细胞介素-10的分泌2组间差异无显著性。AD组调节性T细胞抑制功能受损，与对照组有明显差异。结论AD患者调节性T细胞抑制功能受损，可能与其接触抑制途径缺陷有关。     

调节性T细胞的研究进展

调节性T细胞具有免疫低反应性和免疫调节功能两大特征。它们在自身免疫性疾病的治疗、肿瘤的治疗以及移植耐受的诱导等方面具有广泛的应用价值。本文对调节性T细胞的产生、类型以及在自身免疫性疾病,移植免疫耐受和肿瘤免疫方面的研究进行综述。     

调节性T细胞与常见自身免疫性疾病

人体免疫系统可以通过杀伤受感染的细胞的方式保护不受侵入的病原体与微生物的侵害,而只对正常组织造成最小程度的损害。为了维持这种平衡,CD4＋CD25＋调节性T细胞在控制免疫应答与维持外周免疫耐受中起重要作用。这种T细胞的数量减少或功能的缺失可能导致自身免疫疾病的发生。增强调节性T细胞免疫抑制功能的治疗措施已经被证明可以改善自身免疫性疾病的病情,本文就调节性T细胞的作用机制及与常见自身免疫性疾病的关系做一综述。     

自身免疫性肝病相关抗体与CD4^＋4CD25^＋high调节性T细胞的临床意义探讨

目的探讨自身免疫性肝炎（AIH）患者外周血CD_4^＋CD_25^＋high调节性T细胞的作用。方法抗核抗体酶联免疫分析法检测（ANA）。自身免疫性肝病谱线性免疫分析法（LIVER-LIA）测定抗肝肾微粒体1（LKM-1）、抗肝细胞溶质抗原1（LC-1）、抗线粒体-2（AMA-M2）、抗可溶性肝抗原／抗肝胰抗原（SLA／LP）。用流式细胞仪技术比较分析AIH患者51例、慢性乙型肝炎（CHB）30例及健康正常人20例外周血中的CD_4^＋CD25^＋high调节性T细胞，用免疫组织化学法检测AIH和CHB患者肝组织Foxp3的表达情况。结果AIH占51％（51／100），AIH组外周血中CD4^＋CD25^＋high／CD4^＋百分率显著低于正常组（P〈0．05）和CHB组（P〈0．01），并且CHB组显著高于正常组（P〈0．05）；同时AIH组外周血中CD_4^＋T细胞也显著高于CHB组（P〈0．01）；肝组织Foxp3^＋细胞主要分布于肝小叶内窦周隙、汇管区，AIH组肝组织Foxp3^＋表达显著低于CHB组（P〈0．01）。结论CD4^＋CD25^＋high调节性T细胞下降可能是自身免疫性肝炎发病的原因之一。     

乳腺癌患者外周血调节性T细胞的检测及临床意义

<正>乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤,占女性肿瘤发病的首位,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%,在肿瘤类疾病中其病死率仅次于肺癌。乳腺癌的病因复杂,它确切的发病机制,医学界尚不完全清楚。近年来随着肿瘤免疫学研究的不断深入,已经明确细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的     

调节性T细胞与炎性肠病研究进展

炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)为非特异性炎症性肠病,主要包括溃疡性结肠炎(Ul-cerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。其病因和发病机制尚未完全明确。已知肠道粘膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD中发挥着重要作用。笔者对调节性T细胞在肠道免疫系统中的作用与IBD的发病机制相关性的研究进展做一综述,为临床治疗IBD的新药研究提供可能性的途径。     

FOXP3及调节性T细胞与支气管哮喘的相关性研究

目的检测支气管哮喘患者外周血CD4+T细胞、CD4+ CD25+T细胞、CD4+ FOXP3+T细胞三类亚群,分析其在支气管哮喘患者的表达。方法选择112例支气管哮喘患者和56例正常人作为对照,采用流式细胞术检侧患者外周血的CD4+T细胞、CD4+ CD25+ T细胞、CD4+ FOXP3+T细胞。结果 FOXP3主要表达在CD4+ CD25+T细胞上,CD4+ CD25+T细胞、CD4+FOXP3+T细胞与对照组相比均明显降低(P<0.01),急性发作期哮喘患者外周血中CD4+ CD25+ T细胞、CD4+ FOXP3+T细胞明显低于非急性发作期(P<0.01),与疾病的活动性相关。结论支气管哮喘患者存在明显的免疫功能失调,CD4+ CD25+T细胞、CD4+ FOXP3+ T细胞在疾病活动中起着重要作用,是导致患者细胞免疫功能失调的重要原因。     

自身免疫性甲状腺炎小鼠发病中调节性T细胞、Th17细胞的变化

目的观察高碘诱发自身免疫性甲状腺炎(AIT)动物模型中CD4+CD25+调节性T细胞、Th17细胞的变化。方法选取NOD.H-2h4雌鼠饮0.005%碘化钠水,HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分;测定血清甲状腺球蛋白抗体(TgA b)水平;免疫荧光染色流式细胞仪分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、Th17细胞比例的变化;实时定量RT-PCR检测Foxp3 mRNA、IL-17 mRNA、RORγt mRNA表达水平。结果 NOD.H-2h4小鼠高碘饮水后,甲状腺炎的发生率明显高于对照组,甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺相对重量及血清TgA b水平均较对照组小鼠明显升高(P<0.05)。脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例和Foxp3 mRNA表达量均较对照组明显降低(P<0.01);脾细胞中Th17细胞所占比例和IL-17 mRNA表达量、RORγt mRNA表达水平均较对照组明显升高(P<0.05)。结论 NOD.H-2h4小鼠在高碘诱导发生甲状腺炎时,脾脏CD4+CD25+调节性T细胞比例明显降低,Th17细胞比例明显升高。     

咪喹莫特对哮喘小鼠气道炎症和调节性T细胞的影响

目的:观察咪喹莫特对小鼠哮喘模型气道炎症和调节性T细胞Foxp3表达的影响。方法:建立哮喘模型,第0、7、14天分别腹腔注射卵白蛋白(OVA)及其佐剂,自21 d时开始雾化吸入OVA一次,连续7 d,吸入OVA前0.5 h,咪喹莫特组雾化吸入咪喹莫特30 min(1.5 g/L),地塞米松组腹腔注射地塞米松(4 mg/kg)。最后一次OVA雾化吸入后48 h取左下肺组织做HE染色观察肺组织炎症改变;收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数、分类和ELISA检测。结果:(1)HE染色显示咪喹莫特组小鼠肺组织炎症程度较哮喘小鼠轻。(2)哮喘组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞较正常组显著增加(P<0.01),咪喹莫特组嗜酸性粒细胞比哮喘组显著减少(P<0.01)。(3)哮喘组BALF中IL-5水平较正常组显著升高(P<0.01),咪喹莫特治疗组比哮喘组显著降低(P<0.01)。哮喘组BALF中IL-10水平较正常组显著降低(P<0.01),咪喹莫特治疗组比哮喘组显著升高(P<0.05)。(4)哮喘组脾脏组织Foxp3+细胞数量较正常组减少,咪喹莫特组与地塞米松组较哮喘组增加(P<0.01)。结论:雾化吸入咪喹莫特可在一定程度上增加Foxp3+细胞数量,减轻哮喘小鼠的气道炎症。     

溃疡性结肠炎患者肠黏膜CD4CD25调节性T细胞及Foxp3表达水平的研究

目的 通过分析溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜中CD4+CD25+调节性T细胞及其特异性标志物Foxp3的表达特点,探讨CD4+ CD25+调节性T细胞和Foxp3在UC发病机制中的作用.方法18例UC活动期患者和12例健康体检者作为正常对照组,分别经电子肠镜活检肠黏膜组织,以流式细胞术检测肠固有层单个核细胞( LPMC...     

老年原发免疫性血小板减少症患者治疗前后T淋巴细胞亚群的临床研究

目的 检测老年原发免疫性血小板减少症(ITP)患者治疗前后T淋巴细胞亚群的动态变化, 探讨其在ITP发生发展中的作用。方法 采用流式细胞术测定ITP患者治疗前后及正常对照组外周血T淋巴细胞亚群的水平。结果 ITP患者治疗前后T淋巴细胞绝对值、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值分别为(0.83±0.16)vs(1.74±0.36)、(71.71±1.07)% vs(72.69±1.35)%、(41.78±0.71)% vs(42.46±1.20)%、(29.67±0.97)% vs(28.56±1.75)%、(8.76±0.56)% vs(9.39±1.26)%、(1.42±0.07)vs(1.49±0.13), CD8⁺T淋巴细胞比例治疗后显著降低, 其余均显著升高, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 T淋巴细胞亚群的异常改变, 破坏自身免疫, 与病情相关, 可指导临床治疗, 并作为评估预后的参考指标。     

Resolving the identity myth: key markers of functional CD4+FoxP3+ regulatory T cells

Authenticating markers for the functional suppressive CD4⁺FoxP3⁺ regulatory T cells (Tregs) are important for the quantitative identification and enrichment of viable Tregs for possible therapeutic use. CD25 as a surrogate marker of Tregs has some limitations, which prompted investigators to identify more specific marker(s) of Tregs. The search for a firm molecular definition of Tregs resulted in the identification of FoxP3 as a better marker of this subset of CD4 cells. Nevertheless, FoxP3⁺ Tregs are phenotypically and functionally heterogeneous. Even in normal mice, only a minority of FoxP3⁺ T cells are potent suppressor cells. Therefore, additional marker(s) are required for delineation of truly functional Tregs. In this review, the studies identifying markers of functional Tregs, both in mouse and in human, and their functional implications are discussed. Our finding that TNFR2, which mediates the effect of TNF on the activation of Tregs, is a superb marker of the most suppressive subset of mouse Tregs and its application in the identification of functional human Tregs will also be reviewed.     

小鼠CD8＋记忆性T淋巴细胞的分离、纯化和体外功能检测

目的分离CD8＋记忆性T淋巴细胞,检测其体外部分功能。方法建立小鼠皮肤移植模型,制备受体脾细胞悬液,采用免疫磁珠方法分离Tm细胞、台盼蓝细胞染色检测其细胞活性、流式细胞仪检测分选所得细胞纯度,ELISA方法检测不同抗原刺激Tm细胞后的IL-2和IL-10的浓度。结果小鼠皮肤移植存活率为93.0%（28/30）,皮肤移植皮片平均存活时间（12.18±1.03）d;CD8＋Tm的活细胞百分率为98.5%;流式细胞术检测表型CD8＋CD4＋细胞比例占（97.75±0.9）%,CD8＋CD4-细胞比例占（96.0±1.02）%;在供体脾细胞、刀豆素A、Wistar大鼠脾细胞和无刺激物作用下,2×107mL-1的CD8＋Tm液中细胞因子IL-2和IL-10的浓度分别为：（57.32±6.52）,（38.34±5.21）,（13.51±3.35）,（11.32±2.51）;（9.21±1.02）,（11.52±2.15）,（35.42±4.59）,（39.21±7.3）;差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。结论通过免疫磁性分离技术和流式细胞技术可分离出高纯度的CD8＋Tm细胞,具有良好的细胞特性,为Tm在移植免疫方面的研究提供了技术方法。     

The therapeutic potential of regulatory T cells for the treatment of autoimmune disease

Introduction: Immune tolerance remains the holy grail of therapeutic immunology in the fields of organ and tissue transplant rejection, autoimmune diseases, and allergy and asthma. We have learned that FoxP3⁺CD4⁺ regulatory T cells play a vital role in both the induction and maintenance of self-tolerance.

Areas covered: In this opinion piece, we highlight regulatory T cells (Treg) cell biology and novel immune treatments to take advantage of these cells as potent therapeutics. We discuss the potential to utilize Treg and Treg-friendly therapies to replace current general immunosuppressives and induce tolerance as a path towards a drug-free existence without associated toxicities.

Expert opinion: Finally, we opine on the fact that biomedicine sits on the cusp of a new revolution: the use of human cells as versatile therapeutic engines. We highlight the challenges and opportunities associated with the development of a foundational cellular engineering science that provides a systematic framework for safely and predictably regulating cellular behaviors. Although Treg therapy has become a legitimate clinical treatment, development of the therapy will require a better understanding of the underlying Treg biology, manufacturing advances to promote cost effectiveness and combinations with other drugs to alter the pathogenicity/regulatory balance.     

Deferiprone modulates in vitro responses by peripheral blood T cells from control and relapsing-remitting multiple sclerosis subjects

T cells are important mediators of autoimmune inflammation in relapsing–remitting multiple sclerosis (RRMS). Previous studies found that deferiprone, an iron chelator, suppressed disease activity in a mouse model of multiple sclerosis, and inhibition of T cell proliferation was implicated as a putative mechanism. The objective of the present study was to examine the effects of deferiprone on suppressing in vitro responses of T cells from control and RRMS subjects. Peripheral blood T cells were co-stimulated with anti-CD3+anti-CD28 and cultured with or without interleukin 2 (IL-2). Proliferating CD4+ T cells from control and RRMS subjects, cultured with or without IL-2, decreased in response to 75 μM deferiprone, although the extent of decreased proliferation of CD4+ T cells from RRMS subjects was less than for control subjects. Proliferating CD8+ T cells from control subjects, cultured with or without IL-2, also decreased in response to 75 μM deferiprone, and this decrease was seen in proliferating CD8+ T cells from RRMS cultured with IL-2. CD4+CD25+ and CD8+CD25+ cells from control subjects, cultured with or without IL-2, declined in 75 μM deferiprone, but the decrease was smaller than for the CD4+ and CD8+ proliferative responses. CD4+CD25+ and CD8+CD25+ cells from RRMS subjects showed more variability than for control subjects, but CD4+CD25+ cultured with IL-2 and CD8+CD25+ cells cultured without IL-2 significantly declined in 75 μM deferiprone. CD4+FoxP3+ and CD4+CD25+FoxP3+ cells tended to remain constant or increase. In summary, deferiprone induced declines in proliferative responses at a dosage that is within peak serum pharmacological concentrations.