人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定

目的克隆人前列腺癌基因1（PCAN1）5′上游2.6?kb启动子片段,构建pGL3 p2.6?kb载体, 测定其启动子活性,初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子片段,并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3 basic中,构成pGL3 p2.6?kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP,通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。 使用Erase a system对pGL3 p2.6kb载体中2.6?kb片段进行一系列5′侧翼缺失,产生12个缺失体,分别瞬时转染LNCaP细胞,通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果克隆的PCAN1 2.6?kb启动子片段经测序鉴定正确无误; pGL3 p2.6?kb转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定结果显示2.6?kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示,PCAN1基因上游-1?599?bp?至-1?541?bp、-347?bp至-84?bp的缺失,与2.6?kb?片段相比,启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍,-1?541?bp?至-1?226?bp的缺失,与2.6?kb片段相比,启动子活性降低2.11倍。结论 克隆的人PCAN1基因5′上游2.6?kb片段具有较强的启动子活性,PCAN1基因上游2.6?kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。     

Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。     

survivin启动子有效片段的克隆及其在胃癌细胞AGS中的转录活性研究

目的 克隆survivin启动子的有效片段，并检测它在人胃癌细胞株AGS和人正常胃上皮细胞GES-1中的转录活性，为该启动子在胃癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法 用PCR扩增survivin基因的启动子片段，克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic，构建pGL3-sur-pro重组质粒，用脂质体法瞬时转染AGS及GES-1中，检测survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3-CMV-pro重组质粒作为阳性对照。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增的survivin启动子片段长约440bp，测序结果与GenBank中survivin启动子序列一致。成功构建了pGL3-sur-pro重组质粒。荧光素酶活性检测显示，survivin启动子片段在细胞株AGS中有较高转录活性，而在GES-1中几无转录活性。结论 本实验克隆的survivin启动子有效片段在胃癌细胞株AGS中有转录活性，在正常胃上皮细胞中无活性。其有可能作为调控元件用于胃癌的靶向性基因治疗。     

人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定

目的：克隆Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段，构建pGL3-1．06kb载体，测定其启动子活性。方法：采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3-basic载体中，与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：PCR扩增的1．06kb片段经测序正确无误；pGL3-1．06kb转染LNCaP细胞48h后，双荧光素酶活性测定M1／M2=2．7，为pGL3-control活性的1．5倍，为pGL3-basic活性的50倍。结论：克隆的人Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段具有较强的启动子活性。     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。     

阿尔兹海默病相关基因nicastrin启动子的克隆和鉴定

目的：克隆和鉴定与阿尔兹海默病发生有关的γ-分泌酶的组成蛋白之一nicastrin（NCT）基因的启动子。用于开展其转录调控机制的研究。方法：用PCR方法从人基因组DNA中分离NCT基因编码区上游大小约为1.8kb的片段并以此为基础对启动子进行两端删除分析,分别扩增大小不等的片段,与pGL3-Enhancer荧光素酶报告基因载体质量组,通过瞬时转染Hela细胞,细胞裂解液进行双荧光素酶活性分析,分离NCT基因的启动子区。结果：NCT基因启动子的420bp片段在Hela细胞中具有最强的启动活性,另237bp片段为有活性的最小片段。结论：NCT启动子很可能位于翻译起始位点上游-432／-133处,其基础启动子位于-359／-90。     

人β catenin启动子的克隆及活性分析

目的克隆β catenin基因5′上游1.8?kb启动子,构建启动子 荧光素酶报告基因载体pGL3 1.8?kb,测定其启动子活性,为进一步研究β catenin基因表达调控机制奠定基础。方法采用PCR方法从人基因组DNA中扩增β catenin基因5′上游1.8?kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3 basic载体中,与内参照质粒pRL Tk共转染前列腺癌PC3细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果PCR扩增的1.8?kb片段经测序正确无误;pGL3 1.8?kb转染PC3细胞48?h后,双荧光素酶活性测定启动子活性（M1／M2）为11.71,是pGL3 control活性的2.43倍,为pGL3 basic活性的206.31倍,为pGL3 promoter活性的21.38倍。结论克隆的β catenin基因5′上游1.8?kb片段具有较强的启动子活性。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

目的 构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法 ①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段,业克隆进p2XEB质粒,构建含hTERT肩动了和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur;同理,将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒,构建含猿猴病毒40(SV40)启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro-Fcy::Fur,重组子经酶切鉴定、测序;②RT-PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERT mRNA的表达,荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性;③用超声微泡作载体,将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)共培养后,CCK-8测定转染细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察细胞凋亡;RT-PCR检测Fcy::Fur mRNA的表达.结果 p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur 2种重组质粒酶切和测序结果 与预期完全相符,hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确;SKOV3和MRC-5中hTERT mRNA表达分别为阳性和阴性,hTERT肩动子在SKOV3中活性为26.2%,在MRC-5中为0.65%;p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5(P=0.036),而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-Fc系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别(P=0.87);转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fcy::Fur的SKOV3细胞,均见大量凋亡细胞和Fcy::Fur mRNA表达,而转染p2XEB-Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞,也无Fcy::Fur mRNA表达,与前三者比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB-Fcy::Fur成功构建,p2XEB-Fcy::Furl/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞.     

survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定

目的克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro,克隆入pGL3-Basic,分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro,脂质体转染前列腺癌细胞和Changliver肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,其中S2pro活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的三分之一。结论survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

SARS-CoV 5''''UTR在基因转录中的启动子活性

目的了解SARS-CoV不同毒株5′UTR RNA的构成特点和差异及其空间结构；研究该序列在真核细胞中的启动子活性。方法用软件DNAStar-MegAlign和BLAST分析SARS-CoV5′UTR序列同源性、RNADraw3．0预测二级结构；构建5′-UTR cDNA序列驱动的荧光素酶基因表达质粒pGL3-5′-UTR，转染HepG2细胞，检测萤火虫荧光素酶的表达；构建一套缺失突变质粒，使其分别3′端残留三个、两个、一个和零个（完全缺失）茎环，检测报告基因的表达；采用5′RACE，查找转录起始位点；将pGt3-5′UTR转染A549、HepG2、VeroE6、HeLa和ECV304．检测报告基因的表达差异。结果SARS-CoV5′UTR全长为264nt，18株有缺失突变均位于5′端。101个SARS-CoV 5′UTR序列中．共发现5个点突变位置：SARS-Cov5′UTRRNA可形成稳定的二级结构。Stem-loop-Ⅱ含多个茎环结构，形成复杂的假结；pGL3-5′-UTR有明显的萤火虫荧光素酶表达；当4个茎环都具备时，荧光素酶相对活性是SV40启动子的约43％；失去第一个茎环后。是SV40启动子的约45％；而失去前两个后，则不表达荧光素酶；转录起始位点在SARS-CoV5′UTR的第56位核苷酸；在五种不同细胞中，表达强度由高到低依次是：A549、HepG2、ECV304、HeLa和VeroE6。结论①SARS-CoV5′UTR序列保守，二级结构可形成4个茎环结构域；②SARS-CoV5′UTR有启动子活性；③在二级结构中，与启动子活性有关的结构域在前两个茎环；④SARS-CoV5′UTR在调控基因转录时，第56位核苷酸及其下游的TRS具有重要作用；⑤多种组织或器官都可为SARS-CoV5′UTR发挥启动子功能提供辅助因子，而以肺源性细胞最为适合。     

SARS-COV 5′UTR在基因转录中的启动子活性(英文)

目的了解SARS-COV不同毒株5’UTR RNA的构成特点和差异及其空间结构;研究该序列在真核细胞中的启动子活性。方法用软件DNASTAR-MEGALIGN和BLAST分析SARS-COV5’UTR序列同源性、RNADRAW3.0预测二级结构;构建5’-UTR CDNA序列驱动的荧光素酶基因表达质粒PGL3-5’-UTR,转染HEPG2细胞,检测萤火虫荧光素酶的表达;构建一套缺失突变质粒,使其分别3’端残留三个、两个、一个和零个(完全缺失)茎环,检测报告基因的表达;采用5’-RACE,查找转录起始位点;将PGL3-5’UTR转染A549、HEPG2、VERO E6、HELA和ECV304,检测报告基因的表达差异。结果 SARS-COV 5’UTR全长为264NT,18株有缺失突变均位于5’端。101个SAJRS-COV 5’UTR序列中,共发现5个点突变位置;SARS-COV 5’UTRRNA可形成稳定的二级结构。STEM-LOOP-Ⅱ含多个茎环结构,形成复杂的假结;PGL3-5’-UTR有明显的萤火虫荧光素酶表达;当4个茎环都具备时,荧光索酶相对活性是SV40启动子的约43%;失去第一个茎环后,是SV40启动子的约45%;而失去前两个后,则不表达荧光素酶;转录起始位点在SARS-COV 5’UTR的第56位核苷酸;在五种不同细胞中,表达强度由高到低依次是:A549、HEPG2、ECV304、HELA和VERO E6。结论①SARS-COV 5’UTR序列保守,二级结构可形成4个茎环结构域;②SARSC-OV 5’UTR有启动子活性;③在二级结构中,与启动子活性有关的结构域在前两个茎环;④SARS-COV 5’UTR在调控基因转录时,第56位核苷酸及其下游的TRS具有重要作用;⑤多种组织或器官都可为SARS-COV 5’UTR发挥启动子功能提供辅助因子,而以肺源性细胞最为适合。