多药耐药基因在K562细胞诱导分化过程中的表达

目的　通过组织血浆酶原激活剂 (TPA)诱导K5 6 2细胞分化 ,探讨白血病的多药耐药性。方法　应用体外细胞培养技术 ,通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化 ;用免疫组化 (IC)、流式细胞术 (FCM )、聚合酶链反应 (RT PCR)等技术检测P 糖蛋白 (P gP)的表达和功能及多药耐药基因 1信使核糖核酸 (mdr1mRNA)的表达。结果　TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化 ;在此分化过程中mdr1mRNA表达随作用时间延长而渐增加 ,P gP表达及功能增强。 结论　mdr1mRNA、P gP表达及功能在TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化过程中随细胞分化而上调     

苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达和诱导红系分化

目的研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白mRNA表达及红系分化作用。方法不同水平苦参碱诱导K562细胞6d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因mRNA表达水平的变化。结果K562细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的0.7%最高可上升至15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白mRNA表达增加。结论苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据。     

全反式维甲酸诱导K562细胞铁代谢变化的研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对K562白血病细胞中铁代谢相关基因表达产物(H-Fn、TfR及IRP2)的影响及其相互关系.方法 应用联苯胺、瑞氏、非特异性酯酶、硝基四氮唑蓝还原试验4种染色方法 ,观察ATRA对K562细胞的诱导分化特点;应用流式细胞术检测经ATRA处理后,K562细胞表面抗原CD71及CDl3表达水平的变化;应用RNA/蛋白带移动分析方法 (RNA/protein band-shift assay)检测铁调节蛋白(IRP)的结合活性;采用放射免疫分析法测定K562细胞内铁蛋白含量的变化;采用RT-PCR方法 对ATRA处理的K562细胞H-Fn、TfR及IRP2 mRNA水平的表达进行检测,同时对RT-PCR产物克隆测序.结果 K562细胞经ATRA诱导,出现粒系分化的形态学特征,中幼粒细胞及以后阶段的细胞数明显增多.细胞表面抗原CD71下降而CD13表达升高.ATRA处理组的H-Fn mRNA水平较对照组升高,而IRP2及TfR mRNA减少;处理组IRP结合活性较对照组明显下降,但铁蛋白含量升高.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系方向分化过程中,伴有一系列铁代谢相关基因表达产物的改变,其上游调控机制有待进一步探讨.     

全反式维甲酸对K562细胞的诱导分化作用

目的：全反式维甲酸(ATRA)对肿瘤细胞具有广泛的抑制增殖、促进分化作用。本研究通过体外培养检测ATRA对K562细胞是否具有诱导分化作用。方法：采用联苯胺染色、瑞氏染色、非特异性酯酶染色、硝基四唑氮蓝还原试验4种不同的染色方法及流式细胞术,观察经1μmol/L及2.5μmol/L ATRA诱导1d,4d,5d后,K562细胞出现诱导分化特征。结果：1μmol/L及2.5μmol/L ATRA均可诱导K562细胞向粒系分化。培养4d,1μmol/L ATRA组61.5％的K562细胞、2.5μmol/L组39％的K562细胞显示出向粒系成熟方向分化;培养5d,处理组的分化细胞数仍明显高于对照组(P<0.05),但两种浓度ATRA的诱导分化强度无统计学差异(P>0.05)。且均未出现向红系或单核细胞方向分化的特征。流式细胞仪检测ATRA诱导前后CD13及CD71的表达,1μmol/L ATRA诱导K562细胞1d,CD13抗原表达阳性率为8.0％,2.5μmol/L组则为6.7％,均高于对照组(2.1％)。培养5d,1μmol/L和2.5μmol/L AFRA组的CD13分别升高到28.1％,37.8％,而CD71则分别下降至1.2％和0.9％。与对照组比差异均具有显著性(P<0.05)。结论：ATRA可诱导K562细胞向粒系成熟方向分化。     

β-榄香烯对K562细胞周期与细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的探讨β-榄香烯(β-ELE)对人慢性髓性白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的影响及其机制。方法K562和不同浓度的β-ELE共同培养后,应用流式细胞仪技术和Hoe-chest33258/PI荧光染色法检测β-ELE对K562细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术测定野生型p53活化片段(P21wild-type p53 activated fregmentl,P21WAF1)、Survivin mRNA水平。结果不同浓度β-ELE能使K562细胞阻滞于G1期,G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显下降,呈剂量、时间依赖性,且与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE作用于K562细胞24h,48h后,在G0/G1期前,可见明显的亚二倍体(凋亡峰),其凋亡率呈剂量、时间依赖性,与对照组比较有显著意义(P<0.01)。Hoechest33258/PI免疫荧光技术发现β-ELE能使凋亡细胞数目明显增多(P<0.01)。RT-PCR结果显示β-ELE能下调K562细胞Survivin mRNA表达,上调P21WAF1mRNA的表达(P<0.01)。结论β-ELE能够阻止细胞K562细胞从G1期向S期转换。β-ELE可以诱导K562细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。β-ELE导致细胞周期阻滞可能与上调P21WAF1mRNA的表达有关;促进K562细胞凋亡机制可能与下调Survivin mRNA的表达有关。随着药物浓度的增加,P21WAF1mRNA表达增加,而SurvivinmRNA表达下降。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞诱导分化的研究

目的采用反义寡核苷酸技术研究survivin与白血病细胞K562分化的关系。方法实验分为反义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组,转染后48h观察细胞形态及超微结构的变化;转染后24、48h分别进行联苯胺染色、过氧化物酶染色及硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞功能;流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD33的表达;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平。结果反义寡核苷酸作用后,K562细胞出现向成熟红系及粒系分化的形态学及超微结构的改变,联苯胺染色阳性率、过氧化物酶染色阳性率、NBT还原实验阳性率均高于无义寡核苷酸组、脂质体组及空白对照组(P<0.01);细胞表面分化抗原CD33的平均荧光强度在反义寡核苷酸组降低(P<0.01);反义寡核苷酸作用24h后细胞内survivin蛋白的表达水平低于空白对照组(P<0.05),但与无义寡核苷酸组、脂质体组比较差异无统计学意义(P>0.05),而48h后survivin蛋白表达水平进一步降低,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能诱导K562细胞向成熟红系及粒系方向分化。     

rhG-CSF 抑制脐血CD3AK细胞和其培养上清液诱导K562细胞凋亡的研究

目的　探讨重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF ,G CSF)对脐血CD3 AK细胞及其培养上清液诱导K562 细胞凋亡的影响。方法　用细胞形态学观察 ,DNA琼脂糖电泳 ,原位末端标记法对K562 ;CD3 AK细胞诱导的K562 ;CD3 AK细胞与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 ;CD3 AK细胞培养上清液 (culturalsupernatants,CS)诱导的K562 ;CS与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 进行检测分析。结果K562 自然凋亡率为 (3.5± 1.0 ) % ;CD3 AK细胞诱导的K562 凋亡率为 (2 7.4± 4.9) % ;CD3 AK细胞与大小剂量G CSF共同诱导的K562 细胞凋亡率分别为 (7.4± 3.0 ) %、(12 .9± 3.1) % (F =10 7.94,P <0 .0 1)。CS诱导的K562 细胞凋亡率为 (33.1± 5 .2 ) % ;CS与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 细胞凋亡率分别为 (6 .4± 2 .3) % ;(14.8± 2 .5 ) % (F =183.36 ,P <0 .0 1)。结论　G CSF能部分或全部逆转脐血CD3 AK细胞和其培养上清液诱导的K562 细胞的凋亡。     

ATRA对K562细胞HOXA5基因表达与细胞周期、凋亡的影响

目的本研究旨在通过全反式维甲酸(ATRA)对人髓系白血病细胞株K562细胞的干预来分析同源盒基因(HOX)A5的表达变化及其与细胞周期、凋亡的关系,探讨HOXA5在髓系白血病发生、发展过程中的作用,为临床治疗白血病提供实验依据。方法通过细胞增殖-毒性实验(CCK-8)筛选出ATRA干预K562细胞的最佳浓度值。流式细胞术检测10μmol/LATRA分别干预K562细胞24 h、48 h和72 h后,各组细胞的凋亡情况及细胞周期分布的变化。实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹法测定K562细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达情况,并分析HOXA5 mRNA及蛋白的表达与细胞周期、凋亡的关系。结果 K562细胞中可以检测到HOXA5 mRNA及蛋白的表达,ATRA干预K562细胞后HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高,细胞凋亡率明显增加(P0.05),细胞增殖周期被阻抑在G_0/G_1期,细胞增殖受抑,且HOXA5 mRNA及蛋白的表达量与细胞凋亡率呈正相关(r=0.944,r=0.826),与细胞周期G0/G1期增加百分比呈正相关(r=0.870,r=0.962),与S期降低百分比呈负相关(r=-0.946,r=-0.926)。结论 ATRA干预K562细胞后,细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高;ATRA可能通过上调HOXA5 mRNA及蛋白的表达抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡。     

生长激素促分泌素受体-1a基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的 观察生长激素促分泌素受体-1a(GHSR-1a)基因在3T3一K1肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨GHSR-1a基因在脂肪细胞分化中的作用.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段(第0-8天).通过形态学观察、油红0染色测定脂肪细胞分化程度及脂滴积聚情况,化学比色法测定脂肪细胞三酰甘油(TG)总量,半定量反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测脂肪细胞中GHSR-1a基因mRNA的表达水平.采用SPSS 12.0软件进行组间t检验.结果 3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化前呈梭形的成纤维细胞形态,胞浆内无脂滴;诱导分化后细胞逐渐由梭形变为圆形,胞体变大变圆,胞浆内出现明显的脂滴.3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第4天细胞内TG水平已明显升高,第8天TG水平升高更加明显,与前脂肪细胞相比均有显著统计学意义(Pa<0.01).同时GHSR-1a基因mRNA低表达于3T3-L1前脂肪细胞和分化第1天的脂肪细胞,随着3T3-L1脂肪细胞逐渐分化成熟,分化第4天和第8天GHSR-1a基因mRNA的表达逐渐增加,GHSR-1a基因的表达水平除在诱导分化第0-1天和第1-4天内差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点表达水平比较均有统计学意义(Pa<0.05).结论 3T3-L1脂肪细胞分化过程中GHSR-1a基因表达逐渐上调,其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程一致,可能参与了脂肪细胞分化过程.     

油酸诱导SW872前脂肪细胞分化的作用

目的探讨油酸对SW872前脂肪细胞的诱导分化作用,为体外研究脂肪细胞功能及其相关疾病建立细胞模型。方法体外培养,0.6 mmol/L油酸诱导SW872前脂肪细胞分化,光学显微镜观察SW872前脂肪细胞形态的变化,油红O染色观察胞浆中脂滴的聚集,化学比色法测定细胞中三酰甘油(TG)总量,RT-PCR方法检测不同分化时间点转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2(PPAR-γ2)与CAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)mRNA的时序性表达。结果1.油酸诱导分化24 h时SW872前脂肪细胞胞体由小变大,形态由梭形变为圆形,胞浆中出现细小脂滴;诱导48 h时细胞体积进一步变大,几乎所有细胞形态变圆,胞浆中脂滴明显增多;诱导分化72 h时细胞呈戒环状,胞浆脂滴含量更多,油红O染色胞浆中可见丰富的脂肪染色。2.油酸诱导分化24 h时,细胞中TG总量增多;诱导分化48 h时TG总量是分化前8.5倍;诱导分化72 h时TG总量是分化前14倍(P<0.01)。3.油酸诱导分化24 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达轻度升高;诱导分化48 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达明显升高,分别是诱导分化前的10.23倍和12.91倍;诱导分化72 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达进一步升高,分别是诱导分化前的14.15倍和14.82倍(P均<0.01)。结论油酸刺激72 h能促进SW872前脂肪细胞中TG的合成与积聚,可诱导SW872前脂肪细胞中转录因子PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA时序性表达,成功诱导SW872前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。     

脐血CD3AK细胞培养上清液对白血病细胞株HL-60细胞的影响

目的在体外实验中,研究脐血CD3AK细胞培养上清液（cord blood CD3AK supematant,CS）对HL-60细胞增殖、分化和凋亡的影响。方法以不同浓度的CS（10％CS、15％CS、20％CS）作用于不同时间（3d,6d和9d）的HL-60细胞为实验对象,应用细胞计数法结合锥虫蓝拒染法研究CS诱导的HL-60增殖情况。应用流式细胞仪分析CS作用前后细胞周期及细胞表面分化标志CD11b的变化,光学显微镜下观察细胞形态变化,氯化硝基唑蓝（NBT）还原实验研究细胞的NBT还原阳性百分率,从而研究HL-60细胞的分化。应用电子显微镜观察细胞凋亡,原位末端标记法研究CS作用前后HL-60细胞的凋亡变化。结果随CS作用时间的延长和剂量的增加,细胞增殖速度逐渐减慢。细胞周期分析显示,CS作用后G0期和G1期显著增多,S期显著减少,G2期和M期无明显变化,说明CS使细胞阻滞在G0和G1期。随CS作用时间的延长,细胞体积逐渐增大,3d后被诱导的细胞表面开始表达分化标志物CDm并出现细胞核型变化,NBT阳性细胞增多,随cs浓度的增加和作用时间的延长,这些变化越明显。20％CS诱导72h后,被诱导的细胞出现凋亡,随诱导时间延长,凋亡细胞增多。结论CS能抑制HL-60细胞的增殖,诱导HL-60细胞分化和凋亡。     

低氧对K562细胞侵袭转移的增强作用

［摘要］目的：研究低氧对白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力的影响。方法：细胞体外常规培养,用浓度为1%,3%,5%的氧分别处理细胞24 h,以常氧培养K562细胞为对照组,通过细胞黏附实验检测细胞黏附力,细胞迁移实验检测细胞运动力,肿瘤细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭力,RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达,Western blot检测细胞HIF-1α蛋白的表达。结果：与对照组相比,3%和5%的氧均增强K562细胞黏附力、运动力和侵袭力(P<0.05或P<0.01),而且还能上调K562细胞HIF-1α蛋白,HIF-1α mRNA,VEGF mRNA,MMP9 mRNA,MMP2 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);而1%氧与对照组相比,以上各检测指标无明显变化(P>0.05)。结论：适度低氧能增强白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力,其机制可能是通过HIF-1α上调VEGF,MMP-2和MMP-9表达实现的。［中国当代儿科杂志,2009,11（7）：566-570］     

苦参碱和川芎嗪抑制白血病细胞侵袭转移作用的实验研究

目的探讨苦参碱及川芎嗪对低氧(3%O2)培养条件下人B淋巴细胞白血病细胞株Raji细胞、人慢性髓系白血病细胞株K562细胞侵袭转移的抑制作用及机制。方法体外常规培养细胞,低氧环境下继续培养24 h后,分别加入终浓度为0、0.15、0.2、0.25 g/L苦参碱或0、0.1、0.15、0.2 g/L川芎嗪处理,以常氧培养不加药物的细胞为对照组,分别检测细胞黏附、迁移和侵袭能力,并以RT-PCR方法检测HIF-1α、VEGF mRNA的表达。结果低氧环境下Raji细胞和K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力,以及HIF-1α、VEGF mRNA的表达均较常氧对照组显著增强(P<0.01)。0.15、0.2、0.25 g/L苦参碱均有效抑制低氧环境下Raji细胞的黏附、迁移和侵袭能力,并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05)。0.2、0.25 g/L苦参碱均有效抑制低氧环境下K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05)。0.1、0.15、0.2 g/L川芎嗪均有效抑制Raji细胞、K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力,并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05),均呈剂量依赖性。结论苦参碱和川芎嗪能有效抑制低氧环境下Raji细胞和K562细胞黏附、迁移和侵袭能力,其作用机制可能通过下调细胞内HIF-1αmRNA的表达,从而减少VEGF mRNA的生成来实现。     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 探讨Livin反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞K562增殖、凋亡和耐药的影响.方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),脂质体(Lip)介导转染K562细胞,实验分为Lip-ASODN组、Lip-MSODN组、Lip对照组和细胞对照组4组,采用反转录-PCR法检测Livin mRNA的表达;四甲基偶氮唑蓝法与膜联蛋白V异硫氰酸荧光素法检测Livin ASODN与K562细胞增殖、凋亡及与高三尖杉酯碱(HHT)耐药的关系.结果 Livin ASODN可显著抑制K562细胞增殖(P<0.01),且作用具有时间和浓度依赖性.终浓度为600 nmol·L-1的Lip-ASODN能明显降低Livin mRNA表达,细胞凋亡率达(36.89±1.08)% (P<0.01),而Lip-MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异均无统计学意义(Pa>0.05).Livin ASODN可增加K562细胞对HHT的耐药性,半数抑制质量浓度为(0.37±0.02)mg·L-1;与HHT及小剂量阿糖胞苷联合应用可显著抑制细胞增殖(P<0.01).结论 Livin ASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,增加K562细胞凋亡及其对HHT的敏感性.     

氯丙嗪对白血病细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究氯丙嗪对阿霉素诱导的K562耐药细胞株(K562/AO2)多药耐药的逆转作用及机制,以便为临床应用提供实验依据.方法 (1)以四氮甲基唑蓝(MTT)法检测氯丙嗪的细胞毒性及其对K562/AO2细胞的耐药逆转作用;(2)以流式细胞术检测氯丙嗪处理前后K562/AO2细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积量;(3)以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测氯丙嗪处理前后后K562/AO2细胞中mdr-1 mRNA的表达水平.结果 (1)氯丙嗪在3 μg/ml时对K562/AO2增殖的抑制作用小,抑制率＜5%;(2)氯丙嗪明显增加DNR对K562/AO2的毒性作用(P＜0.05),耐药逆转倍数为1.901;(3)氯丙嗪可明显增强DNR在K562/AO2细胞内的蓄积(P＜0.05);(4)氯丙嗪对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA的表达水平无影响.结论氯丙嗪通过增加K562/AO2细胞内DNR的蓄积显著提高 K562/AO2细胞对DNR的敏感性,其逆转白血病细胞多药耐药的机制与mdr-1基因无关,还有待进一步探讨.