Comparison of Several Methods for Detection of FEPAS Beef Listeria Monocytogenes

目的:探讨在食品检验中单核细胞增生性李斯特菌的检验方法.方法:采用常规培养法、全自动酶联免疫荧光分析仪筛选法、基因探针化学发光检测法、实时荧光定量PCR检测法对英国食品检验能力评价体系(FEPAS)牛肉单核细胞增生性李斯特菌水平测试提供的二份盲样(M164d02A和M164d02B)进行检测.结果；4种检测方法检测结果一致,样本M164d02A检出单核细胞增生性李斯特菌、样本M164d02B未检出单核细胞增生性李斯特菌,而实时荧光定量PCR检测法灵敏度较高,检测周期较短、特异性较高.结论:实时荧光定量PCR检测法在单核细胞增生性李斯特菌的检测中具有灵敏度高、检测时间短、特异性高等特点.     

单核细胞增多性李斯特菌荧光定量PCR检测

目的　探索建立快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌的PCR检验方法。方法　以单核细胞增多性李斯特菌hly A基因作为靶序列设计一对引物,并以单核细胞增多性李斯特菌标准菌株中提取的DNA作为模板,用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行鉴定。结果　含有一段特异基因的6 0 0 bp片段,表现出良好的单核细胞增多性李斯特菌种特异性。结论　荧光定量PCR比普通PCR特异性强、灵敏度高、重现性好,可以定量、快捷地应用于检测单核细胞增多性李斯特菌。     

单核细胞增生李斯特菌hlyA基因实时荧光PCR的建立与研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查。方法根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针,建立和优化实时荧光PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,并在食品卫生检验中与细菌分离方法同步应用比较。结果建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系,经优化其最佳退火/延伸的温度为58°C,25μL反应体系中上、下游引物和探针最佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.4μmol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35 min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应,对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/μL的稀释梯度,对同一核酸浓度样本20次检测的Ct值变异系数为0.46%;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用中,6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性,从相应样本中分离出6株单核细胞增生李斯特菌,实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致。结论针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势,可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高效筛查。     

深圳市食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况调查

目的了解深圳市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的污染状况，并评价不同方法的检测效果。方法分别用传统分离培养方法和荧光PCR方法进行分离培养及检出鉴定。结果从178份样品中检出3份(株)单核细胞增生性李斯特氏菌，检出率为1．68％。结论深圳市食品中存在单核细胞增生性李斯特氏菌污染的危险，需加强食品中单核细胞增生性李斯特氏菌监测。用传统方法结合荧光PCR方法能提高单核细胞增生性李斯特氏菌的检出率和准确性。     

PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

目的:建立一种快速准确检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法:采用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因(hly A),用PCR方法检测80份长春地区的食品样品。结果:在706 bp处出现hlyA基因的目的片段,食品样品中单核细胞增生李斯特氏菌阳性检出12份,阳性率为15%,与吉林省疾病预防控制中心同步进行的国标法检测结果一致,二者符合率100%。结论:PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌更简便、快速、敏感、特异性高,适用于基层单位开展食品中单核细胞增生李斯特氏菌污染的调查及监测。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

肺炎衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的:探讨实时定量PCR检测肺炎衣原体(chlamydia pneumonia,Cpn)的方法.方法:根据GenBank提供的肺炎衣原体基因序列,选取高特异性和保守型的区域进行引物设计,并建立实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)的检测方法.同时用肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒对Cpn引物的特异性进行分析.对呼吸道感染患者200个咽拭子样本和68个肺泡冲洗液样本进行检测,以荧光抗体检测法作对照,评价实时定量PCR检测Cpn的准确性.结果:Cpn PCR引物对肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒均显示阴性,对Cpn显示为阳性,特异性良好;荧光实时定量PCR技术检测的准确性优于荧光抗体检测法.结论:荧光实时定量PCR技术检测Cpn体灵敏度高、周期短,可作为临床诊断Cpn的手段.     

实时荧光定量PCR法在淋病奈瑟菌感染检测中的应用效果分析

目的:探讨实时荧光定量PCR法在淋病奈瑟菌感染检测中的应用效果。方法:选取淋病奈瑟菌感染检测患者298例为研究对象,分别采用培养检测法及实时荧光定量PCR法从检测线性范围、检测重复性、检测灵敏度、检测特异性及检测试剂稳定性等方面进行比较。结果:经两组方法比较,在检测线性范围、检测重复性、检测灵敏度、检测特异性及检测试剂稳定性等方面,PCR检测法显示了一定的优势,但也存在一定的漏检率。结论:临床上应充分应用各种检测方法的优势,使之相互补充,以提升淋病奈瑟菌的检出率。     

三重PCR鉴定消毒牛奶及其加工环境中的单核细胞增生李斯特菌

目的建立三重PCR体系用于鉴别消毒奶及其加工环境中的单核细胞增生李斯特菌。方法以李斯特菌属细菌中共有的编码P60蛋白的iap基因和单核细胞增生李斯特菌特有的编码溶血素的hly基因为靶目标设计引物,用于三重PCR扩增。结果李斯特菌属细菌的iap基因在二重PCR的扩增片断为1.45 kb,单核细胞增生李斯特菌溶血素的hly基因的扩增片断为420bp;在三重PCR体系中单核细胞增生李斯特菌除了扩增到420 bp的hly基因片断以外,iap基因以700 bp的小片断取代了1.45 kb的大片段,而同属的其他细菌仍旧扩增iap基因1.45 kb的大片段。结论所建立的三重PCR法能扩增出李斯特菌属细菌的预期条带,此方法对肉汤培养物的检测灵敏度为3.2×101cfu/m l,对人工污染牛奶的检测灵敏度为1.4×102cfu/m l,高水平L.innoc-ua(108cfu/m l)共存不影响单核细胞增生李斯特菌的特异性检出。三重PCR还可以直接鉴别出培养3~6小时后的含有单核细胞增生李斯特菌(1.45×100~1.45×101cfu/m l)的牛奶。     

同时检测四种病原菌的PCR方法分析

目的本文主要是讨论同时检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌的四种在食物感染常见的病原菌的快速PCR检测方法。方法选取我中心从2010年3月-2011年3月检验科收集的病原样本共60例作为研究对象。其中包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌。采用多重PCR检测方法进行检验。结果将需要检测的4中病原菌加入需扩增浓度混合液中,并且加入PCR扩增体系中进行PCR扩增。结果显示没有出现有扩征带,并且4种病原菌均出现其特异性扩增带,说明4种病原菌之间没有相互干扰,而且没有出现假阳性结果。结论多重PCR病原菌检测方法能准确检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌等四种常见的肠道病原,值得在卫生应急食物中毒事故处理中推广使用。     

3种方法检测结核分枝杆菌的比较

目的比较荧光定量PCR与抗酸染色、结核抗体检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,及在临床诊断中的应用价值.方法对48例临床确诊的结核病患者和21例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用荧光定量PCR法和痰涂片抗酸染色法检测,并分离患者外周血血清检测结核抗体,对3种检测方法的结果进行分析比较.结果抗酸染色法检测结核杆菌阳性率为22.9%,特异性为100%;血清结核抗体检测阳性率为77.1%,特异性为85.7%;荧光定量PCR检测阳性率为52.1%,特异性为100%.结论荧光定量PCR是一种快速、防污染、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值.     

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确，适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对4株标准株及4株无关茵进行PCR扩增，得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段，而同属的L.welshimefi、L．grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份，检出率为90％，高于传统分离培养法（60％）。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。     

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌

目的比较荧光定量PCR与抗酸染色、结核抗体检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,评价荧光定量PCR检测临床标本中结核杆菌的应用价值。方法对48例临床确诊的结核病患者和21例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用荧光定量PCR法和痰涂片抗酸染色法检测,并分离患者外周血血清检测结核抗体,对3种检测方法的结果进行分析比较。结果抗酸染色法检测结核杆菌阳性率为22.9%,特异性为100%;血清结核抗体检测阳性率为77.1%特异性为85.7%;荧光定量PCR检测阳性率为52.1%,特异性为100%。结论荧光定量PCR是一种快速、防污染、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

食品中单核细胞增生李斯特菌分离及药敏试验的研究

目的：了解食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的污染状况及药敏情况。方法:菌株分离鉴定应用国家卫生标准检验方法、API法和多聚酶链反应(PCR)；药敏试验采用Kirby—Bauer法。结果:李斯特氏菌(李氏菌)总污染率为5．18％(16／309)，其中生肉和水产品均为8％、熟肉制品为11．51％、生牛奶为3．51％、乳制品和蔬菜均未检出，Lm检出率为1．29％(4／309)，经PCR测定4株Lm同时含有内化素基因和李氏溶血素O基因，并且溶血试验与小鼠致病力试验均为阳性。药敏试验选用12种抗生素，4株Lm对庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、红霉素、氯霉素、四环素、头孢噻吩、头孢唑啉敏感；对依诺沙星和呋喃妥因耐药。结论:李氏菌在多种食品中均有不同程度的污染，4株Lm小鼠致病力阳性；溶血试验和PCR测定的溶血素基因是鉴别Lm的一个重要方法，Lm对多种抗生素敏感，对依诺沙星和呋喃妥因耐药。     

4种食源性致病菌污染状况调查

目的了解肇庆市食品中沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O157:H7和副溶血性弧菌的分布状况、动物储存宿主的种类、菌株生物学特点,初步确定可能污染上述致病菌的高危食品,为食物中毒监测提供科学依据。方法依据国标方法,采用进口显色培养基。对样本分别进行沙门氏菌、单增李斯特菌、EHEC O127:H7和副溶血性弧茵分离、生化及血清学鉴定。结果监测生肉(猪、牛、鸡)、熟肉、水产品三类样品共58件,共检出致病菌6株,总检出率10．3％。其中分离沙门氏菌4株,检出率6．9％;单增李斯特菌2株,检出率3．4％:EHEC O157:H7和副溶血性弧菌均未检出。3类食品中致病菌阳性率最高的为生肉(17．9％),其次为水产品(5．0％),熟肉未检出致病菌。结论肇庆市居民主要消费食品存在食源性致病菌污染,其中生肉是主要污染食品品种,生肉(猪肉)中沙门氏菌带菌率较高(30．0％),主要血清型为德尔卑沙门氏菌,熟肉未检出致病菌。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

铜川市2011-2015年市售食品的食源性致病菌污染状况分析

目的 初步掌握和分析2011-2015年铜川市市售食品中主要食源性致病菌的污染水平,发现影响食品安全的高危食品,确定危害因素的分布和可能来源,为开展食品安全风险评估和采取有针对性的控制措施提供科学依据.方法 采取随机抽样方法,于2011-2015年连续在铜川市餐饮服务环节中采集12大类795份食品样品,依据《陕西省食源性致病菌监测工作手册》及食品安全国家标准食品微生物学检验指定的方法对食品样品进行6种食源性致病菌的检测.结果 12大类795份样品中共检出各类致病菌62株,总检出率为7.80％,2011-2015年的检出率分别为7.66％、8.21％、9.01％、7.55％和6.67％.食源性致病菌在不同食品中的检出率分别为生肉类31.15％、凉拌菜25.93％、地方特色食品16.22％、流动早餐6.67％、熟肉制品5.92％、速冻米面制品2.50％、餐饮食品-米面制品2.20％、婴幼儿食品0.91％、糕点及饼干、即食非发酵性豆制品、冷冻饮品、酱及酱制品未检出致病菌.不同种类食品间食源性致病菌检出率差异有统计学意义(P＜0.01).致病菌检出率分别为沙门菌2.01％、单核细胞增生李斯特菌1.89％、金黄色葡萄球菌3.02％、阪崎肠杆菌0.13％、蜡样芽胞杆菌0.75％、志贺菌未检出.在不同种类食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的检出率高于其它食品,差异均有统计学意义(P＜0.01),其中生肉类中的沙门菌的检出率最高,为14.75％;凉拌菜中单核细胞增生李斯特菌的检出率最高,为11.11％;地方特色食品蜡样芽孢杆菌的检出率最高,为5.41％.结论 铜川市2011-2015年市售食品的食源性致病菌污染率有所下降,但仍存在一定污染,其中沙门菌污染的生肉类、单核细胞增生李斯特菌污染的凉拌菜及蜡样芽胞杆菌污染的地方特色食品是高危食品,建议卫生监督部门加强食品安全管理,采取针对性的控制措施,预防和控制食源性疾病的发生.