IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的：构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体,高效表达IL-33蛋白。方法：采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）mRNA中扩增IL-33 cDNA;将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。结果：扩增的IL-33 cDNA大小为800bp左右。表达的IL-33融合蛋白大小为45kDa左右,Western blotting鉴定显示表达的蛋白正确,为IL-33目的蛋白。但表达的大部分蛋白为无生物学活性的包涵体,在后续对表达蛋白进行纯化的同时对蛋白进行了复性,得到了复性后具有生物学活性的IL-33蛋白。结论：成功制备了具有生物学活性的IL-33蛋白。     

重组人IL-29的原核表达、纯化及活性分析

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人白细胞介素-29(IL-29). 方法:用PCR技术扩增人IL-29成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-44 Ek/LIC中,构建融合表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-29融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后用肠激酶消化除去N端融合标签得到完全天然状态的重组人IL-29,经N-端氨基酸测序鉴定纯化的IL-29,用细胞病变抑制法测定其活性. 结果:成功构建了表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,DNA序列测定结果与预期结果一致. 在30℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-29融合蛋白占菌体蛋白总量43%左右,并且大部分以可溶形式存在. 纯化后的融合蛋白经肠激酶切割和回收后,所得目的蛋白(IL-29)纯度大于96%,该蛋白N-端序列与理论值一致,其抗病毒活性与IFN-α2b相当. 结论:获得了具有生物学活性的重组人IL-29.     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的：制备p62DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法：用PCR方法扩增编码p62Dok PTB结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL－21,构建成表达GST－PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后,经Glutathion-Sepharose 4B亲和层析柱纯化,用SDS－PAGE进行分析,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的25％。结果：获得重组GST－PTB融合蛋白,纯度在95％以上,产物得率约75％。结论：成功制备高纯度p62DokPTB结构域的GST融合蛋白,为进一步研究p62DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

人心肌营养素在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定

目的利用大肠杆菌高效表达可溶性具有生物学活性的重组huCT-1蛋白。方法采用PCR及T-A克隆将huCT-1开放阅读框基因克隆到pMD-18T载体上，再构建原核表达载体pGEX2T-huCT1。在不同温度不同时问，通过IPTG诱导pGEX2T—huCT1在DH5a大肠杆菌中表达，SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白比例。GST亲和柱纯化huCT-1融合蛋白，凝血酶酶切融合蛋白并纯化。坐骨神经切断模型观察重组huCT-1对脊髓前角神经元的存活作用，结果构建了huCT-1的融合表达载体pGEX2T-huCT1。通过IPTG诱导，发现29℃诱导4h，目的蛋白表达量占全菌的1／5，可溶性蛋白与包涵体比为2／5。对其进行亲和柱纯化，GST/huCT-1融合蛋白纯度达到85％以上。融合蛋白酶切后，重组huCT-1蛋白纯度达到80％以上。发现原核表达重组huCT-1蛋白能挽救55％成年大鼠脊髓运动神经元的存活。结论成功地获取了具有生物活性的huCT-1的原核重组蛋白。     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的:在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法:将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Western blot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性. 结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Western blot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500 u/mg. 结论:高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.     

东亚钳蝎钙通道样毒素的克隆与其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆东亚钳蝎钙通道样毒素(BmCa)基因,并构建原核表达质粒,在大肠杆菌中重组表达该毒素蛋白.方法:以东亚钳蝎尾毒腺的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增并克隆BmCa的cDNA基因,并将该基因重组到PET-GST表达载体中,转化入大肠杆菌BL21并诱导表达,采用Ni-SuperChelating Resin柱亲和层析纯化,用小白鼠毒性实验检测融合蛋白的活性.结果:成功克隆BmCa基因并构建原核表达质粒,IPTG诱导后表达分子质量约为33KD的融合蛋白,含量为大肠杆菌总蛋白的25%,经亲和层析得较高纯度的融合蛋白,小白鼠毒性实验表明融合蛋白具有活性.结论:在大肠杆菌中成功表达了有活性的东亚钳蝎钙通道样毒素蛋白,为其功能研究奠定基础.     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体,并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中,采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h）,目的蛋白获得较高表达量,且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566,TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达,经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。     

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。     

人微管蛋白失稳剂Oncoprotein18原核表达载体的构建及表达

目的：原核表达人Oncoprotein18(Op18)蛋白,为制备抗Op18的mAb作准备．方法：从人皮肤组织中用RT-PCR扩增Op18 cDNA的全长编码序列,克隆人表达载体pRSETA中,构建Op18的高表达工程菌,并以IPTG诱导表达目的蛋白,通过亲和层析法纯化表达的Op18融合蛋白。结果：酶切及测序鉴定证明,获得含有目的基因片段的重组质粒,表达的Op18融合蛋白以可溶性的形式存在．结论：所获Op18融合蛋白以可溶性的形式存在,为制备其mAb及进一步研究Op18在创伤愈合及瘢痕形成中的作用打下了基础。     

多拷贝人C肽基因的构建及其原核表达研究

目的构建多拷贝的人C肽基因,选用合适的表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人C肽。方法采用PCR、克隆、DNA序列分析、IPTG诱导表达和亲和层析等方法构建多拷贝的人C肽基因。结果构建成含5拷贝C肽基因的重组pET-30 a表达载体,经转化及诱导,可在大肠杆菌中高效稳定表达可溶性的带6个组氨酸标签的C肽融合蛋白。结论在大肠杆菌中获得了人C肽的高表达,为下一步C肽的功能研究创造了重要条件。     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

乙醇对结核分枝杆菌Mr 38 000 蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

目的：探讨乙醇促进结核分枝杆菌Mr 38000蛋白的可溶性表达，并获得可溶性的Mr 38000重组蛋白．方法：采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Mr 38000蛋白的编码基因，用限制性内切酶消化后插入载体pGEx-4T-2中，将重组质粒转化大肠杆菌BL21。在乙醇添加剂存在下，经IPTG诱导，表达GST-38融合蛋白；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分析融合蛋白的相对分子质量及表达形式，免疫印迹法鉴定融合蛋白的活性．结果：经PCR扩增后证实为Mr 38000蛋白的基因，成功构建了具有正确基因序列的重组表达载体，在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白约占菌体总蛋白的18％．在乙醇存在下，可溶性目的蛋白的表达量约是无乙醇时的5倍．结论：在原核表达中乙醇作为一种添加剂可以促进结核分枝杆菌Mr 38000蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达．     

肿瘤血管导向肽与人突变IL-2融合蛋白的克隆、表达及生物学活性分析

目的获得具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽（NGR）融合表达的突变人IL-2蛋白.方法将突变人IL-2与NGR的融合基因重组到表达载体pET-22b（＋）并转化E.coli BL21（DE3）,测序正确后,IPTG诱导表达,并对产物进行纯化、复性和鉴定.结果目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%以上,Western blot分析显示纯化后的目的蛋白具有免疫结合活性,CTLL-2细胞增殖实验证明具有生物学活性.结论具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽融合表达的重组人IL-2蛋白可成功地克隆并表达,为进一步的肿瘤导向治疗打下基础.