肾母细胞瘤过度表达基因mRNA在大鼠中枢神经系统的原位杂交定位

为了了解肾母细胞瘤过度表达基因（ＮＯＶ）ｍＲＮＡ在中枢神经系统的定位，用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针原位杂交组织化学方法，研究了ＮＯＶ原癌基因ｍＲＮＡ在成年大鼠中枢神经系统的分布。结果显示，在颞叶、听区、梨状前皮质、纹状皮质、海马复合体、杏仁基内侧核、杏仁皮质核、杏仁内侧核、杏仁外侧核、丘脑腹后内侧核、丘脑腹后外侧核、丘脑外侧背核、下丘脑腹内侧核、下丘脑背侧核、下丘脑背内侧核、下丘脑弓状核、脑桥面神经核、脑桥网状结构、前庭神经外侧核、前庭神经上核、脊髓前角均有较多ＮＯＶｍＲＮＡ阳性神经元分布，提示ＮＯＶ原癌基因在大鼠中枢神经系统内可能起重要作用     

面口部炎症刺激增强CGRP mRNA、PPTA mRNA及NOS在大鼠三叉神经节中的表达

为了研究ＣＧＲＰｍＲＮＡ、ＰＰＴＡｍＲＮＡ和ＮＯＳ在伤害性刺激后大鼠ＴＧ中合成和表达的变化，将４％鹿角菜胶（ＣＡＲ）溶液注射到大鼠一侧口周皮下作为伤害性刺激模型，用ＮＡＤＰＨ－ｄ组织化学法结合ＣＧＲＰ、ＰＰＴＡｍＲＮＡｓ原位杂交组织化学法对此进行了观察。结果显示：对照组大鼠ＴＧ中约有３２．２％、１６．２％和１０％的神经元分别呈ＣＧＲＰｍＲＮＡ、ＰＰＴＡｍＲＮＡ和ＮＯＳ阳性。ＣＡＲ刺激后，在刺激侧ＴＧ、ＣＧＲＰｍＲＮＡ、ＰＰＴＡｍＲＮＡ和ＮＯＳ阳性神经元的数量均增多，其阳性率分别达到了３８．６％、２２．８％和１４．２％。ＴＧ中约有６．８％和７．３％的神经元同时呈ＮＯＳ和ＣＧＲＰｍＲＮＡ或ＮＯＳ和ＰＰＴＡｍＲＮＡ阳性，ＣＡＲ刺激使得两种双标神经元的数量也明显增多，双标细胞占ＴＧ细胞总数的百分比分别达到了１１．０％和１０．９％，而且刺激后增加的ＮＯＳ阳性神经元主要为双标神经元。上述结果提示ＣＧＲＰｍＲＮＡ、ＰＰＴＡｍＲＮＡ和ＮＯＳ阳性神经元，尤其是共存神经元可能在面口部伤害性信息的传递和调节中起重要作用，伤害性刺激所诱导的ＮＯＳ合成的增加与ＣＧＲＰｍＲＮＡ和ＰＰＴＡｍＲＮＡ表达的增强可能有密切的关系。     

含Calbindin－D28K mRNA神经元在大鼠脊髓中的分布──原位杂交组织化学法观察

用原位杂交组织化学技术，对大鼠脊髓内含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ的神经元的分布状况进行了观察。发现含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ的神经元见于脊髓灰质的各层，但是，不同区域或核团中所含阳性神经元的数量和标记强度各不相同。其中含强阳性神经元的部位有：Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ层及前角外侧运动柱的内侧部；含中等阳性神经元的部位有：Ⅲ、Ⅷ层及中间带；有的区域仅含弱阳性神经元，如：Ⅵ层及中央区，而中间带外侧核及前角的大型运动神经元未见到阳性杂交信号。Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ在大鼠脊髓内的区域特异性分布特点，提示其在神经系统的某些生理功能中可能有重要作用。     

含Calbindin—D28K mRNA神经元在大鼠脊髓中的分布—原位杂交…

用原位杂交组织化学技术，对大鼠脊髓内含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ ｍＲＮＡ的神经元的分布状况进行了观察。发现含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ ｍＲＮＡ的神经元见于脊髓灰质的各层，但是，不同区域或核团中所含阳性神经元的数量和标记强度各不相同。其中含旨阳性神经元的部位有：Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ层及前角外侧运动柱的内侧部；含中等阳性神经元的部位有：Ⅲ、Ⅷ层及中间带；有的区域仅含弱阳性神经元，如：Ⅵ层及中央区，而     

大鼠延髓内含前—原脑啡肽mRNA,甲硫氨酸—脑啡肽和亮氨酸—脑啡肽神…

应用原位杂交和免疫组织化学方法，对成年大鼠延髓内含前－原脑啡肽（ＰＰＥ）ｍＲＮＡ和甲硫氨酸－脑啡肽（Ｍ－ＥＮＫ）与亮氨酸－脑啡肽（Ｌ－ＥＮＫ）免疫反应神经元进行观察。结果表明：含ＰＰＥｍＲＮＡ的神经元胞体，多数分布在孤束核、腹外侧压以及两者之间的网状结构等形成的一条从背内侧到腹外侧区的弧形带内。Ｍ－ＥＮＫ与Ｌ－ＥＮＫ样免疫反应阳性结构（神经元胞体、纤维和终末）也主要密集分布在该带内。本结果对ＥＮＫ     

大鼠小脑和下橄揽核中含Calbindin－D28KmRNA的神经元的生后发育

本实验应用原位杂交组织化学方法观察了大鼠小脑皮质和下橄榄核中含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ的神经元的生后发育过程。发现在刚出生时，小脑浦肯野氏细胞已含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ，其表达水平在生后第３周时达高峰并持续至成年期。但在下橄榄核中，含Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８ＫｍＲＮＡ的神经元在生后第７天时才出现，其数量及标记强度在生后第３、４周时迅速增加，并达成年水平。结合以往的资料分析，在小脑中，Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ可能与浦肯野氏细胞的成熟（突起的形成及伸长、突触的形成）过程有关。而在下橄榄核中，Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ主要参与成年期神经元的正常生理功能。     

大鼠脊髓和后根节内5—HT1A,2A受体mRNA阳性神经元的分布

目的 观察大鼠脊髓及后根节内５－ＨＴ１Ａ,２Ａ受体ｍＲＮＡ阳性神经元的分布。方法 原位杂交组织化学技术。结果 （１）５－ＨＴ１Ａ受体ｍＲＮＡ阳性神经元分布于脊髓灰质各层,主要见于一角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）及Ⅲ、Ⅳ层,Ⅴ、Ⅶ层和Ｘ层也有散在分布。在角（Ⅸ层）内仅有小量阳性神经元;（５）５－ＨＴ２Ａ受体ｍＲＮＡ阳性神经元的分布较局限,主要见于后角浅层及前角（Ⅸ层）神经元,在其他各层仅呈散在分布。在大鼠后根节内观察到：（１）１０．４％的后根节细胞呈５－ＨＴ１Ａ受体ｍＲＮＡ阳性,阳性细胞以中、小型节细胞为主;（２）１７．４％的后根节细胞呈５－ＨＴ２Ａ受体ｍＲＮＡ阳性,阳性细胞也以中、小型节细胞为主。结论 ５－ＨＴ１Ａ和５－ＨＴ２Ａ受体在脊髓和后根节内具有不同的分布特点,它们在介导５－羟色胺在脊髓水平的镇痛及在外周的致痛作用中     

静注免疫球蛋白对新生儿单个核细胞IL-2、IL-4 mRNA表达的调节

目的探讨静注免疫球蛋白（ＩＶＩＧ）抑制体外脐血Ｂ细胞免疫球蛋白释放的机制。方法运用ＲＴ－ＰＣＲ法观察ＩＶＩＧ对体外新生儿单个核细胞（ＣＢＭＣ）分泌的ＩＬ－２ｍＲＮＡ及ＩＬ－４ｍＲＮＡ表达的影响。结果佛波醇乙酯结合钙离子导入剂（ＰＭＡ＋ＩＯＮＯ）激活ＣＢＭＣ，很容易检测到ＩＬ－２ｍＲ－ＮＡ的表达，但不能检测出ＩＬ－４ｍＲＮＡ的表达。将ＰＨＡ刺激后的ＣＢＭＣ与ｒＩＬ－２一起孵育，再用ＰＭＡ＋ＩＯＮＯ刺激，ＣＢＭＣ始表达ＩＬ－４ｍＲＮＡ。在活化后的ＣＢＭＣ接受ＰＭＡ＋ＩＯＮＯ再刺激的同时加入ＩＶＩＧ（５ｍｇ／ｍｌ）。发现ＩＶＩＧ抑制了上述两种细胞因子ｍＲＮＡ的表达。结论ＩＶＩＧ对ＩＬ－２，ＩＬ－４两种细胞因子产生的抑制可能源于转录到分泌至胞外整个阶段任一时相上的抑制     

孤束核内生长抑素mRNA分布的原位杂交组化研究

用原位杂交法对孤束核尾侧部内生长抑素ｍＲＮＡ（ＳＯＭｍＲＶＡ）的分布进行了研究。ＳＯＭｍＲＮＡ位于不同平面孤束核内的神经元胞体和近端树突中，从ＳＯＭｍＲＮＡ阳性神经元一般为中小型细胞，呈圆形或椭圆形，分布于孤束核的内侧亚核、背侧亚核、背外侧亚核、连合亚核、中间亚核、腹侧亚枝和腹外侧亚核，其中以最后区上段及其吻侧平面的孤束核的内侧亚核、连合亚核、背侧亚核和背外侧亚核最为多见。结果提示ＳＯＭｍＲＮＡ阳性神经元在该核尾侧部各亚核内的广泛分布可能与该核参与对血压、心血管、呼吸、胃肠道等内脏活动的中枢控制有密切关系。生长抑素作为一种神经调制物可能在上述孤束核参与的植物性神经复杂整合功能中起着重要的作用。     

高原低氧对大鼠下丘脑生长抑素和γ-氨基丁酸含量的影响

目的：观察高原低氧大鼠下丘脑前生长抑素原（ＰＰＳ）ｍＲＮＡ和γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）含量变化。方法：应用大鼠高原低氧模型及原位杂交技术和氨基酸测定法,检测下丘脑前ＰＰＳ－ｍＲＮＡ神经元数量和ＧＡＢＡ的含量。结果：高原低氧组大鼠下丘脑ＧＡＢＡ的含量明显增多,室周核、室旁核、弓状核ＰＰＳ－ｍＲＮＡ阳性神经元数目增加,而ＧＡＢＡ受体拮抗剂荷包牡丹碱使高原低氧大鼠下丘脑ＰＳ－ｍＲＮＡ阳性元数目增多更为显著     

多聚乙酸亚胺介导基因转移

目的 采用一种新的多聚阳离子化合物－多聚乙酰亚胺（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ,ＰＥＩ）,作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。方法 骨骼肌细胞取生新生ＳＤ大鼠,经胰酶消化后培养,将ＬａｃＺ基因ＤＮＡ－ＰＥＩ复合物导入骨骼肌细胞内,最后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色法检测已转染的细胞。结果 ＰＥＩ可作为介导剂使ＬａｃＺ基因在培养的骨骼肌细胞中表达,其表达率可达到３０％。结论 ＰＥＩ在真核细胞中实施     

IL-2基因直接转移促进CD4+缺损小鼠免疫功能的恢复

目的探讨ＩＬ－２基因直接转移治疗小鼠ＣＤ４缺陷的可能性。方法ｐＣＩ－ｈＩＬ－２质粒ＤＮＡ直接注入ＣＤ４缺陷小鼠大腿肌肉内。用免疫组化法检测ｈＩＬ－２蛋白的表达，同时测定小鼠的免疫功能。结果ｐＣＩ－ＩＬ－２质粒ＤＮＡ可在注射部位肌纤维内表达ＩＬ－２蛋白。ＣＤ４缺陷小鼠脾细胞中ＣＤ４＋Ｔ细胞增多，脾细胞对有丝分裂素ＣｏｎＡ增殖反应明显增强。对ｓＲＢＣ的免疫应答无论是体液免疫或细胞免疫应答均高于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论ｐＣＩ－ＩＬ－２质粒ＤＮＡ直接肌内注射可部分纠正ＣＤ４缺陷小鼠的免疫功能。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的 :研究感染hIL 2重组病毒的人肺腺癌细胞 (Anip973)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用。方法 :将携带有hIL 2基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2 )感染人肺腺癌细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 :rAd hIL 2经扩增、纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒量为30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。转染的Anip973肿瘤细胞其生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4小时细胞培养上清IL 2的分泌量为 2 0pg 1ml 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd hIL 2的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 :腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2转染的Anip973肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化 ,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

不同细胞因子基因转导对小鼠B16细胞体内生长及免疫原性的影响

目的：通过比较不同细胞因子基因转导对肿瘤细胞体内生长及对机体免疫活性的影响,探讨基遥作用机制及因子间的协同效果。方法：采用逆转录病毒介导的方法将ＩＬ－６／ＩＬ－２融合基因及ＩＬ－６、ＩＬ－２单基因分别导入小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞中,检测基因修饰瘤细胞体内成瘤及对机体ＬＡＫ、ＣＴＬ活性的诱导。结果：三种基因修饰的肿瘤细胞均可表现出体内生长抑制及免疫原性增强,但融合基因转导细胞的改变,较单一基因修饰细胞     

Immunotherapy for SV40 T/t antigen-induced breast cancer by recombinant adeno-associated virus serotype 2 carrying interleukin-15 in mice

Human interleukin-15 (hIL15) exerts anticancer effects through the activities of lymphokine-activated killer (LAK) cells. However, its short half-life hinders its clinical application. Recombinant adeno-associated virus serotype?2 (rAAV2) is used for hIL15 gene transfer vectors, because of its low immunogenicity and long-term gene expression in human clinical trials. SV40?T/t antigens are related with many human epithelial cancers and are generally found in human breast cancer. In order to demonstrate the anticancer effects of hIL15 on SV40?T/t antigen-induced breast cancer, rAAV2-hIL15 was constructed and an SV40?T/t antigen-induced transgenic mouse breast cancer model was established. Our study showed that rAAV2-hIL15 could express the hIL15 protein with anticancer bioactivity. In addition, rAAV2-hIL15 could activate the cytotoxic activity of LAK cells in?vivo. Furthermore, the rAAV2-hIL15 successfully delayed cancer growth and eventually led to cancer cell death in SV40?T/t antigen-induced breast cancer transgenic mice. In summary, our study indicates that rAAV2-hIL15 may be applied for cancer immunotherapy of SV40?T/t antigen-induced breast cancer.     

人可溶性IL-6R基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的在ＣＯＳ７细胞中表达具有生物学功能的人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ），作为研究ｓＩＬ－６Ｒ结构与功能关系的基础。方法首先利用ＰＣＲ技术扩增出人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）编码基因片段，并重组入克隆载体ｐＡＬＴＥＲ－１。通过基因序列分析确定了目的基因的核苷酸序列，并进一步构建了由ＳＶ４０晚期启动子和ＨＣＭＶ早期启动子控制的表达质粒ｐＳＶＬ６Ｒ和ｐＣＭＶ６Ｒ。用脂质体介导的方法将表达质粒转染ＣＯＳ７细胞，并分别在ｍＲＮＡ水平（斑点杂交）和蛋白水平（ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。在７ＴＤ１，ＬＴ１２两种ＩＬ－６反应细胞系上检测转染细胞上清（含ｓＩＬ－６Ｒ）的生物学活性。结果在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平分别检测到ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达，表达产物分子量约为５００００。表达产物在７ＴＤ１，ＬＴ１２细胞系上检测到明显的生物学活性。结论天然ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的成功表达为进一步制备ｓＩＬ－６Ｒ突变体及其结构与功能关系的研究奠定了基础     

中国流行株HIV—1gag和hIL—2／hIL—6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的 探讨中国流行株ＨＩＶ－１ｇａｇ与ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达重组核酸疫苗闰的免疫效果。方法 以核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质料ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－２、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－６,通过间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ｇａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,进行淋巴细胞转化试验、ＣＤ４＾＋、ＣＤ８＾＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测,结果 构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性ＣＴＬ反应,当和ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达时免疫效果更加显著。讨论 与Ｇａｇ蛋白共表达的ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－     

白细胞介素32γ通过活化核转录因子κB通路诱导LX-2细胞表达基质金属蛋白酶9

目的：研究白细胞介素?32（Interleukin?32， IL?32）可否诱导肝星状细胞LX?2表达基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9， MMP?9）。方法用不同浓度的IL?32γ与LX?2细胞共培养，收集细胞培养上清，用TRizol试剂提取细胞总RNA，用定量 PCR检测MMP?9 RNA表达水平， MMP?9蛋白质表达水平用酶联免疫吸附试验（ enzyme?linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒检测。接下来将Nuclear factor kappa B （ NF?κB）亚基p50、 p65真核表达载体pCMV?p50、 pCMV?p65单独或联合转染LX?2细胞，48 h后收集细胞培养上清，酶联免疫吸附测定（ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检测MMP?9蛋白质表达水平。将不同浓度的NF?κB抑制剂SN50加入IL?32γ与LX?2细胞共培养的培养液中，48 h后收集细胞培养上清，用ELISA检测MMP?9蛋白质表达水平。结果 IL?32γ可以诱导人LX?2细胞表达MMP?9，且其表达水平随IL?32γ浓度增加而增强； NF?κB亚基p50、 p65可以诱导LX?2细胞MMP?9表达增高； NF?κB抑制剂SN50阻断NF?κB通路可降低IL?32γ诱导的MMP?9表达。结论 IL?32γ通过活化NF?κB通路诱导LX?2细胞表达MMP?9， IL?32可能通过诱导肝星状细胞表达MMP?9参与肝纤维化形成。     

In vitro production of human interleukin 1 alpha and interleukin 1 beta by peripheral blood mononuclear cells examined by sensitive sandwich enzyme immunoassay

The in vitro production of human interleukin 1 alpha (hIL 1 alpha) and interleukin 1 beta (hIL 1 beta) by peripheral blood mononuclear cells was examined by sensitive sandwich enzyme immunoassays which could discriminate hIL 1 alpha and hIL 1 beta without cross-reaction with human IL2. In culture supernatants of mononuclear cells, two components were detected by sandwich enzyme immunoassay for hIL 1 alpha or hIL 1 beta. The molecular weight of one component was shown to be equal to that of recombinant hIL 1 alpha or hIL 1 beta by gel filtration. The elution volume of the other component corresponded to a molecular weight of about 30,000. The sum of the two components for both hIL 1 alpha and hIL 1 beta in culture supernatants of peripheral blood mononuclear cells from healthy subjects increased 1.7 to 38-fold by Escherichia coli lipopolysaccharide. The sum of the two components for hIL 1 beta was 13 to 97-fold larger than that for hIL 1 alpha.