锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA的研究

目的探讨锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)作用。方法以天然HBV感染HepG2细胞为模型,通过应用荧光定量PCR法测定细胞中HBV-DNA水平来检测锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抑制HBV效果,并应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)进行锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对HepG2细胞的毒性研究。结果锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对细胞的最大无毒剂量(TD0)分别为1.5、3.0和1.5g/L;用HBV感染HepG2细胞,分别加入锌、铁、锰饱和乳铁蛋白,各实验组对HBV-DNA均有显著抑制作用,浓度为1.5g/L的锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抗HBV-DNA结果经对数转换后分别为:(5.746±0.114)、(6.446±0.103)和(5.999±0.725)。结论当HepG2细胞感染乙肝病毒后,锌、铁、锰饱和乳铁蛋白可以显著抑制HBV-DNA,抑制作用强弱依次为:锌饱和乳铁蛋白>锰饱和乳铁蛋白>铁饱和乳铁蛋白。     

白介素4对乙型肝炎病毒体外复制和表达的影响

目的 探讨IL-4对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg及HBV DNA复制的抑制作用,认识Ⅱ-4在抗HBV感染中的作用.方法 通过MTT比色法检测不同浓度重组IL-4(rIL-4)对HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用,用ELISA检测rIL-4对HepG2.2.15细胞不同时相HBsag和HBeAs分泌的作用,用实时荧光定量PCR检测rIL-4对HBV DNA合成的影响.结果 rIL-4的各浓度对HepG2.2.15细胞无细胞毒性作用;rIL-4处理HepG2.2.15细胞后,不同浓度组HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量在96 h的差异具有统计学意义(P＜0.05),但rIL-4的浓度低于100ng/mL的各组,HBsAg和HBV DNA含量在处理48 h时,各组间无明显差异(P＞0.05).此抑制作用随rIL-4浓度的增加而增强.结论 rIL-4在体外有直接的抗HBV作用.     

乙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞的初步研究

目的建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验模式。方法在六孔板上培养HepG2细胞,用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞,设立感染组和对照组。用HBV阳性血清和感染组细胞共孵育24 h,0.01 mol/L PBS清洗细胞后,每孔板中加入4 ml DMEM细胞培养液,每隔12 h收集细胞上清液至PBS洗后84 h。收集完最后一次细胞上清液,收集细胞培养板中的细胞。ELSIA检测细胞培养上清中HBsAg;PCR方法检测细胞培养上清和细胞中HBV DNA;免疫荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA的含量。结果HBV感染组细胞培养上清,在PBS洗后第12 h,ELISA即可检测到HBsAg并持续到84 h,PCR检测感染组细胞培养上清和感染组细胞的HBV DNA均阳性。荧光定量PCR检测感染组细胞培养上清中HBV DNA的结果:感染组PBS洗后(0 h)的HBV定量为阴性,而在PBS洗后36 h8、4 h细胞培养上清中HBV的量达到5×105,3×106copies/ml)。结论用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验是可行的。     

HBIG抑制HBsAg、HBV DNA分泌的体外实验研究

目的研究乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）对肝细胞的跨膜转运作用和对乙型肝炎病毒（HBV）感染细胞模型的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、HBVDNA分泌的抑制作用。方法用含HBIG的培养基培养QSG7701细胞，在不同时间点定量检测培养上清的抗HBs，计算HBIG的透过率；用含HBIG的培养基培养HepG2．2．15细胞数天，或先以，定浓度的HBIG共培养，第3天后更换为不含HBIG的培养基继续培养细胞。于不同时间点定量检测培养上清的HBsAg、HBV DNA；用MTT比色试验观察药物的细胞毒性。结果浓度为0.1～0.4IU／mL的HBIG与QSG7701细胞共孵育48h时，细胞内约有38％～46％的HBIG。浓度为0．1～10.0IU/mL的HBIG作用第3、6．9天时能抑制HepG2，2．15细胞培养上清中HBsAg、HBV DNA的分泌（P〈0．01）。住尤药物继续培养的第5、7天，培养卜清中HBsAg浓度较有药物培养的第3天低且继续下降（P〈0．01），第9～11天逐步增高；培养上清HBV DNA水平在第5天时也较有药物培养的第3天低并继续下降（P〈0．01），第7～11大时逐步增高。结论在体外细胞实验中，HBIG能跨膜转运入肝细胞内，细胞内外的HBIG能抑制HBsAg、HBV DNA的分泌。     

反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究

目的 探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒（HBV）感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。方法 用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸（AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道。以HBV DNA转染的HepG2．2．15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况。结果 当AsON的最佳作用浓度为10μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为;57％、60％、52％和56％、45％、56％,AsON对HBV抗原的凶制作用具双峰现象。无关序列无明显抑制作用（＜12％）。利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40μmol/L时,对细胞代谢无毒副作用。结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌。     

化学合成多肽体外抗HBV复制的研究

目的 观察人工设计并化学合成的多肽在体外乙型肝炎病毒（HBV）复制模型中对HBV-DNA复制、病毒标志物表达的影响，及其细胞毒性强弱，筛选高HBV抑制且低细胞毒性的多肽，探索多肽作为新型HBV抗病毒药物分子的潜力。方法 采用传统的甲基丙烯酸聚合物平台设计并合成的7种多肽（KBDT-1、2、3……7，以疏水性及阳离子电亲和力大小为依据），将7种化学合成多肽（10 mg/mL）、拉米夫定（1 mg/mL，阳性对照）、空白溶剂（阴性对照）作用于HepG 2.2.15细胞系，检测化学合成多肽对HBV的抑制作用，采用结晶紫染色法检测细胞存活率，比较各组药物对细胞毒性的强弱。选取HBV抑制作用最强的多肽，设置10、1、0.1 mg/mL浓度梯度，分别处理HepG 2.2.15细胞3、6、9 d后，收集细胞上清液，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测病毒DNA拷贝量，化学发光微粒子免疫分析法检测HBsAg及HBeAg的变化。结果 从7种化学合成多肽中筛选出多肽KBDT-2，RT-PCR结果显示，KBDT-2具有体外抗HBV复制作用，且药物浓度越高，抑制效果越好；化学发光微粒子免疫分析法检测显示，KBDT-2对HBV生物学标志物HBsAg及HBeAg有抑制作用；结晶紫染色检测结果显示，KBDT-2对HepG 2.2.15无明显毒性作用。结论 KBDT-2具有抑制HBV复制作用，且无明显细胞毒性，可以有效降低HBsAg、HBeAg表达，为探索抗HBV新型药物提供了实验数据支持。     

新生儿乙肝疫苗的兔疫效果观察

本文报道279名母亲HBV感染状态不同的5组新生儿应用不同剂量乙肝疫苗后的免疫阻断及免疫应答。结果显示各组新生儿免疫后均获得较高的抗-HBs阳转率及抗体水平。使用30—30—30μg乙肝疫苗阻断母亲HBsAg、HBeAg双阳性产妇的新生儿,保护率为78.9％;使用30—30—30μg和30—10—10μg阻断母亲HBsAg单阳性产妇的新生儿,前者新生儿HBsAg均阴性,后者保护率达80.2％;使用30—10—10μg和10—10—10μg免疫HBV阴性母亲的新生儿,抗体平均滴度分别为349.33IU/L和207.61IU/L。二者差异无显著性。通过观察认为对HBsAg、HBeAg双阳性母亲的新生儿应用30—30—30μg,HBsAg单阳性母亲新生儿应用30—10—10μg,HBV阴性母亲新生儿应用10—10—10μg为宜。     

EGCG对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子机制。方法不同浓度EGCG对HepG2细胞进行干预后,CCK-8法检测EGCG对肝癌HepG2细胞增殖的影响;荧光显微镜及流式细胞术(FCM)Annexin V-FITC/PI双染法检测EGCG对HepG2细胞的凋亡诱导作用;Transwell侵袭实验检测EGCG对HepG2细胞侵袭的影响;ELISA法检测HepG2细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果EGCG各浓度组干预HepG2细胞24、48h后,细胞的生长增殖均明显受到抑制,其24h IC25值和IC50值分别为58.19和133.90mg/L。以60、135mg/L EGCG干预肝癌HepG2细胞24h后,FCM结果显示药物组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05),荧光显微镜观察显示随着药物浓度的增加,细胞凋亡程度加重。Transwell侵袭实验显示,60、135mg/L EGCG对HepG2细胞侵袭力抑制率分别为69.47%和100%(P<0.05)。ELISA检测结果显示,EGCG干预后HepG2细胞上清液中MMP-2和VEGF表达水平下降(P<0.05)。结论 EGCG对人肝癌HepG2细胞具有抑制增殖和侵袭作用,其机制可能与EGCG诱导HepG2细胞凋亡和抑制肿瘤细胞中MMP-2及VEGF表达水平有关。     

脱氧野尻霉素抑制乙型肝炎病毒复制的体外实验研究

目的探讨脱氧野尻霉素（Deoxynojirimycin,DNJ)及其衍生物N 丁基 脱氧野尻霉素（N butyl Deoxynojirimycin,N butyl DNJ)的体外抗乙型肝炎病毒（HBV）作用。方法以HepG2 2.2.15细胞为模型,与药物共培养观察9 d,于第3、6、9 d收集培养上清行乙型肝炎表面抗原及e 抗原(HBsAg及HBeAg)、HBV DNA定量检测。结果培养第9 d,1 000 μg/mL DNJ、100 μg/mL N butyl DNJ 具有较明显抑制病毒复制的作用,与对照组比较,差异均具显著性（均P＝0.001）。结论DNJ及其衍生物在实验浓度下无明显和直接的细胞毒性作用,分别在1 000 μg/mL、100 μg/mL具有较明显的抑制HBV复制的作用。     

几丁聚糖对镉抑制HepG2细胞DNA修复酶hOGG-1表达的影响

目的研究几丁聚糖对氯化镉抑制HepG2细胞DNA氧化损伤修复酶hOGG-1表达的影响。方法在氯化镉染毒HepG2细胞的同时,于培养液中加入不同浓度的几丁聚糖,采用Western blotting法检测氯化镉单独作用以及几丁聚糖和氯化镉联合作用下HepG2细胞DNA氧化损伤修复酶hOGG-1的表达水平。结果①以40μmol/L氯化镉染毒HepG2细胞24h后,细胞内hOGG-1表达显著下降;几丁聚糖对照组与正常对照组相比,hOGG-1表达差异无统计学意义;②不同浓度几丁聚糖和氯化镉联合作用组HepG2细胞hOGG-1的表达水平均较氯化镉单独作用组高,随着几丁聚糖浓度的增加,hOGG-1表达逐渐增强,并且在高剂量几丁聚糖(0.5g/L)和氯化镉联合作用组差异有统计学意义。结论几丁聚糖对氯化镉致HepG2细胞hOGG-1表达水平降低有拮抗作用。     

Inhibition of In Vitro Infection of Hepatitis B Virus by Human Breastmilk

Despite the presence of hepatitis B virus (HBV) in the human breastmilk of mothers infected with HBV, it has been shown that breastfeeding does not increase the risk of mother-to-child transmission (MTCT) of HBV. We tested the hypothesis that human breastmilk may contain active components that bind to HBV and inhibit the infectivity of HBV. The results show that human whey significantly inhibited the binding of the hepatitis B surface antigen (HBsAg) to its antibodies in competitive inhibition immunoassays. The far-western blotting showed that HBsAg bound to a protein of 80 kD in human whey, which was identified as lactoferrin by mass spectrometry. Competitive inhibition immunoassays further demonstrated that both human lactoferrin and bovine lactoferrin bound to HBsAg. Human whey, human lactoferrin, and bovine lactoferrin each significantly inhibited the infectivity of HBV in vitro. Our results indicate that human breastmilk can bind to HBsAg and inhibit the infectivity of HBV, and the active component is lactoferrin. The findings may explain the reason that breastfeeding has no additional risk for MTCT of HBV, although human breastmilk contains HBV. Our study provides experimental evidence that HBV-infected mothers should be encouraged to breastfeed their infants     

新生儿乙型肝炎病毒感染情况的研究

目的 了解广州市新生儿围产期ＨＢＶ的感染情况。方法 采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和斑点发校技术对２４１例新生儿脐血的乙肝病毒标志物进行检测。结果 广州市新生儿围生期ＨＢｓＡｇ阳性率为２．０７％（５／２４１）,ＨＢｓＡｇ阴性、单纯Ａｎｔｉ－ＨＢ阳性且ＨＢＶ ＤＮＡ阳性者１９例,占７．８９％（１９／２４１）,新生儿脐血ＨＢＶ感染率为９．９６％（２４／２４１）,现症ＨＢＶ感染母亲的新生儿脐血ＨＢＶ     

GM-CSF治疗HBV宫内感染婴儿的临床作用及对血清Thl/Th2类细胞因子的影响

【目的】 初步观察重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-monocyte colony stimulating factor,GM-CSF)作为酵母重组乙型肝炎疫苗(rHBvac)的佐剂对HBV宫内感染婴儿治疗临床作用及对血清Thl/ Th2细胞因子的影响。 【方法】 新生儿出生时及1个月龄检查乙肝五项HBsAg(＋)和HBV DNA＞1 000 copy/mL者分为两组:治疗组 20例,新生儿出生后给予乙肝疫苗10 μg三角肌肉注射(疫苗注射时间按0、1、6方案),乙肝免疫球蛋白200 U臀部肌肉注射,20 d 1次,共3次,注射乙肝疫苗后3 d同一部位皮内注射GM-CSF 10 μg/kg。对照组20例,乙肝疫苗10 μg三角肌肉注射(0、1、6方案),乙肝免疫球蛋白200 U臀部肌肉注射,20 d 1次,共3次。1岁时抽外周静脉血检测乙肝五项、HBV DNA的变化及血清IL-4和IFN-γ水平。 【结果】 治疗组7个月婴儿HBsAg转阴率25%(5/20),对照组7个月婴儿转阴率为5%(1/20),两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗组IFN-γ水平高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),IL-4水平两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 【结论】 GM-CSF 联合乙肝疫苗及乙肝免疫球蛋白可提高HBV宫内感染儿HBsAg转阴率,并调节Th1/Th2细胞因子平衡,对HBV宫内感染儿有一定的治疗作用。     

The modulation of HBsAg level by sI126T is affected by additional amino acid substitutions in the S region of HBV

The hepatitis B surface antigen (HBsAg) is a vital serum marker for hepatitis B virus (HBV) infection. Amino acid (AA) substitutions in small hepatitis B surface protein (SHBs) are known to affect HBsAg level. However, how the genetic backbones of SHBs sequences would affect the roles of a specific AA substitution on HBsAg level remains unclear. In this study, we found that sI126 had a very high substitution detection rate of 17.54% (40/228) in untreated chronic hepatitis B cohort with subgenotype C2 HBV infection. Among different substitution types at sI126, the sI126T (N = 28) was found to be associated with significantly lower serum HBsAg level. Clone sequencing revealed that sI126T-harboring SHBs sequences had varied genetic backbones with zero to nine additional AA substitutions. Thus, we constructed 24 HBsAg expression plasmids harboring sI126T without (plasmid 1, P1) or with (P2-P24) additional AA substitution(s) and studied them in the HepG2 cells. The HBsAg levels were determined by both ELISA and Western blot. In vitro experiments showed that P1 significantly reduced HBsAg level and its secretion (p < .05), however, P2-P24 showed various extracellular and intracellular HBsAg levels. No significant differences were detected among the HBsAg mRNA levels of nine representative mutant plasmids. Our findings suggest that the modulation of HBsAg level by sI126T is affected by additional AA substitution(s) in the S region of HBV. The effects of AA combination substitutions in SHBs sequences on HBsAg levels are worthwhile for more attentions in terms of HBV biology and its clinical application.     

“大三阳”患者HBeAg浓度与HBV复制水平的关系

目的分析“大三阳”患者的HBeAg浓度与HBV复制水平的关系，并探讨用化学发光法检测HBeAg浓度用于HBsAg阳性病例与HBV复制水平的相关性。方法随机抽取其中血清“大三阳”患者共143例，应用荧光定量PCR（fuorescence quantitative PCR，FQ—PCR）和化学发光法（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）测定乙型肝炎病例的血清HBeAg浓度。比较不同DNA复制水平病例的HBeAg浓度，以及不同HBeAg浓度病例的DNA水平，同时进行HBeAg浓度与DNA水平相关性分析。结果血清HBeAg浓度与HBVDNA复制水平呈正相关，结论血清HBsAg和HBeAg阳性乙型肝炎病例血清HBeAg浓度与HBV复制水平有一定相关性，相关性R≥0．95。