多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用

多重置换扩增技术（MDA）是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点。尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断（PGD）实验研究和临床应用中仍取得巨大进展。MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断。     

全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断

植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇,从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查,通过分析选择正常的胚胎移植,可以防止遗传学异常妊娠的发生,将产前诊断提前到胚胎植入子宫内膜之前。避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。但由于可用于PGD分析的材料为胚胎中取出的个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞,这些材料十分有限,所以在进行PGD之前,需对单细胞进行全基因组扩增（whole genome ampliflication,WGA）,全基因组扩增一组在基因组DNA数量极有限情况下对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术,其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量,对进行疾病诊断的组织或单个细胞的基因组进行大量扩增,使得后续分析的模板量增加,从而完成多位点、多基因的检测研究。该技术能很好的解决PGD的标本少和准确性要求高等要求。本文介绍了WGA方法中PEP、DOP—PCR、MDA应用于PGD的情况,分析了MDA方法的优势与不足。     

植入前诊断的现状和发展

植入前诊断(PGD)技术的应用已有10年,其所采用的基本技术包括胚胎活检、聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH).随着分子诊断技术的发展,现在又有了荧光PCR、多重PCR和全基因组扩增等,并且许多研究者用五种甚至更多探针检测染色体异常.未来具有发展前景的分子技术包括定量PCR、DNA指纹和微阵列技术,其中用于分析单个细胞染色体的新技术包括已用于临床的分裂间期核转变和仍有待完善的比较性基因组杂交.这些技术都能在单细胞水平诊断多种疾病并使诊断结果更精确.     

植入前诊断的现状和发展

植入前诊断(PGD)技术的应用已有10年,其所采用的基本技术包括胚胎活检、聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)。随着分子诊断技术的发展,现在又有了荧光PCR、多重PCR和全基因组扩增等,并且许多研究者用五种甚至更多探针检测染色体异常。未来具有发展前景的分子技术包括定量PCR、DNA指纹和微阵列技术,其中用于分析单个细胞染色体的新技术包括已用于临床的分裂间期核转变和仍有待完善的比较性基因组杂交。这些技术都能在单细胞水平诊断多种疾病并使诊断结果更精确。     

下一代测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

以下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)为代表的基因组学技术的迅猛发展给全面深度的染色体筛查和基因诊断提供了机会。NGS也迅速应用于胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)临床检测中,成为常规检测技术,经济与可靠使其具有更广阔的应用前景。单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术的进步使得NGS在PGD和PGS的临床应用中能够更加全面了解植入前胚胎的遗传学信息,可以检测到更加细微的差异;基于NGS技术的PGS和PGD将给移植成功率和试管婴儿(in-vitro fertilization,IVF)出生率带来明显提升。本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术,单细胞全基因组扩增技术以及NGS在PGD/PGS中的应用。     

单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用

目的探讨单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)中的应用效果。方法选取2012年3月—2017年3月在本院生殖中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)并在胚胎种植前需进行遗传学诊断(PGD)的夫妇95例为研究对象,抽取这些病例冻存的第三天卵裂期胚胎细胞50枚、第五天囊胚期囊胚15枚和活检后第三天胚胎形成囊胚8枚,经过单个卵裂球细胞与囊胚期滋养外胚层细胞的活检,以及单细胞全基扩增和高通量测序,分析囊胚扩增成功率及总的扩增成功率、染色体正常检出率及异常率以及胚胎临床资料分析。结果第三天卵裂期胚胎共50枚,扩增成功率为76.0%(38/50);第五天囊胚期囊胚15枚,扩增成功率为93.3%,活检后第三天卵裂期胚胎形成囊胚8枚,扩增成功率为100.0%(8/8)。总的扩增成功率为82.2%(60/73);第三天卵裂期胚胎的总异常率为63.2%、囊胚为45.5%,总体异常率为56.7%。基因扩增成功率因为高龄、性别以及反复植入因素分别为89.0%、49.3%、40.0%;染色体异常检出率因为高龄、性别以及反复植入因素分别为73.8%、30.6%、25.0%。结论单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用效果和价值较高,可以弥补囊胚形成率低无可活检的胚胎用于PGD难题,更有利于高通量测序技术的临床推广和应用。     

X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学诊断方法学研究

目的:采用多重置换扩增(MDA)建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断(PGD)方法,可应用于X-连锁慢性肉芽肿病的PGD。方法:采用16个位于CYBB基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-连锁慢性肉芽肿病家系进行单体型分析,采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及特异性扩增CYBB基因进行分析,同时采用位点Amel进行性别诊断。结果:家系分析结果显示共有7个STR位点具有多态性。共进行了10个单淋巴细胞及10个单卵裂球的MDA,全部扩增成功。对致病基因CYBB外显子8的聚合酶链反应(PCR)扩增效率为100%,其中1个单淋巴细胞发生致病位点的等位基因脱扣(ADO),10个单卵裂球诊断结果均为215 bp,未检测出异常的204 bp条带,ADO率为10%(1/10);对于7个有多态性的STR位点和位点Amel,PCR扩增效率为96.9%(155/160),ADO率为11.3%(13/115)。结论:采用MDA结合致病基因特异性扩增及单体型分析在单细胞水平对X-连锁慢性肉芽肿病进行检测,两者相结合可避免污染、ADO等导致的误诊,可提高PGD的诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础。     

植入前诊断的现状和发展

植入前诊断（PGD）技术的应用已有10年,其所采用的基本技术包括胚胎活检、聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交（FISH）。随着分子诊断技术的发展,现在又有了荧光PCR、多重PCR和全基因组扩增等,并且许多研究者用五种甚至更多探针检测染色体异常。未来具有发展前景的分子技术包括定量PCR、DNA指纹和微阵列技术,其中用于分析单个细胞染色体的新技术包括已用于临床的分裂间期核转变和仍有待完善的比较性基因组杂交。这些技术都能在单细胞水平诊断多种疾病并使诊断结果更精确。     

胚胎植入前遗传学诊断/筛查的应用研究进展

胚胎植入前遗传学诊断(PGD)/筛查(PGS)是目前临床上较为常用的新型胚胎植入前遗传学检查方法。PGD主要用于在胚胎移植前检测特定的突变以及非平衡染色体异常是否传递到卵子或胚胎。PGS主要用于检测胚胎染色体的非整倍性。本文主要综述PGD和PGS目前在临床上的应用情况,为胚胎植入前遗传学检查方法的选取提供理论依据。     

单核苷酸多态性微阵列在胚胎植入前遗传学诊断中的应用

胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是在体外受精过程中,对具有遗传风险患者的卵裂期胚胎或囊胚进行细胞活检和遗传学诊断,以选择移植正常的胚胎,从而获得健康的婴儿,是辅助生殖技术的重要组成部分。随着检测技术的发展,更多的方法被用于PGD的单细胞诊断。单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism array,SNP array)是近年来用于PGD诊断的一种新的分子细胞遗传学技术,具有诊断快、可同时诊断46条染色体、分辨率高、可检测单亲二倍体、不受异常染色体类型限制、可追溯种植胚胎来源及异常胚胎额外染色体的来源等优势,同时也在辅助生殖的其他方面有着广泛的应用。     

NASBA和RPA两种等温扩增技术在病原菌检测中的应用研究

依赖核酸序列扩增和重组酶聚合酶扩增技术是在PCR基础上发展起来的等温扩增技术。本文介绍了这两个技术的反应原理、引物探针设计原则以及优势，根据其简便、准确性好、灵敏度高、周期短的特点进一步对该技术在病原菌检测中的应用予以综述及展望。     

全基因组扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用

全基因组扩增技术是一种对微量DNA进行均衡扩增的方法,用于各类遗传检测,对于获取细胞数目及DNA量非常有限的植入前遗传学诊断是十分可贵的。该项技术主要包括经热循环扩增和恒温扩增两类方法,其中恒温扩增的多重置换扩增法为近几年发展起来的技术,目前多重置换扩增法在植入前遗传学诊断中的应用正备受关注。对全基因组扩增技术的常用方法,尤其对多重置换扩增法及其在植入前遗传学诊断中的应用现状做综述。     

DNA环介导恒温扩增试验检测结核分枝杆菌的研究

目的探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法采用涂片抗酸染色法、罗氏培养法和DNA环介导恒温扩增(LAMP)试验对结核分枝杆菌进行检测,并对其检出率进行比较。结果 LAMP试验检出率最高,罗氏培养法次之且检测时间长,抗酸染色法的检出率最低。结论 LAMP试验检测痰结核分枝杆菌具有快速、敏感、简便、特异等优点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

一株汉坦病毒的分离及基因鉴定

目的分离汉坦病毒并采用分子生物学方法进行基因鉴定.方法组织细胞培养法和RT-PCR法.结果在黑线姬鼠体内分离出一株汉坦病毒,分别用HTN型和SEO型的特异引物对其进行基因扩增,同时以76-118株和L99株作对照,结果分离株经HTN型引物扩增出一条明亮带并同76-118株结果一致.结论分离株经基因鉴定为HTN型病毒.     

杭州市库蚊复组抗性相关酯酶Estβ基因类型和频率及动态分布

目的 了解杭州市尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶基因类型、频率和动态分布,为蚊虫防制提供对策。方法 采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法进行抗性相关酯酶的基因分型,对2003-2005年杭州市自然种群库蚊酯酶基因的频率进行动态监测。同时结合酯酶淀粉凝胶电泳技术检测抗性酯酶基因表型监测。结果 连续3年用PCR-RFLP法对酯酶等位基因的分子分型结果表明,杭州市存在4种酯酶基因类型,主要存在世界范围内广泛分布的酯酶Estβ1（50％～54％）纯合型,其次是Estβ2（29％～34％）纯合型,Estβ1／B2（5％～10％）杂合型和一种新的EstβN（3．13％）纯合型等位基因型。用淀粉凝胶电泳分析2005年杭州市库蚊种群的抗性酯酶基因表型,主要是Estβ1型（61％）,其次是Estα2／β2型（12％）,Estαβ／β8型（7％）,敏感表型（29％）。结论 杭州市自然种群尖音库蚊复组存在多种抗性酯酶基因型,2003-2005年来Estβ1型为主,其次是Estα2／β2型,在2005年发现EstβN,是一个新的酯酶基因型,但是比例较低,仅占3．13％。该新的酯酶基因可否引起新的杀虫药剂的抗性,尚有待进一步的跟踪研究。扩增酯酶基因分子分型与抗性酯酶表型,也都表明了一致性。     

核酸信号放大检测及纳米技术的应用

近年来发展迅速的核酸信号放大检测方法有效地提高了核酸检测的灵敏度，文章对枝状核酸信号放大系统(bDNA)，侵染检测(Invader)，滚环扩增方法(RCA)的检测原理、分析性能以及临床应用等相关问题进行了评述，重点描述了纳米粒子在放大核酸检测信号中的应用，并对信号放大方法与模板扩增方法进行了对比。     

志贺菌依赖解旋酶DNA恒温扩增技术建立

目的利用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA),建立一种快速检测志贺菌(Shigella)的新方法。方法根据志贺菌的ipaH基因序列设计特异性引物,优化反应体系和反应条件;并对方法进行特异性和灵敏度评价。结果对21株实验菌株检测,3株志贺菌均为阳性,其余18株非志贺菌均为阴性,灵敏度为5.1×103cfu/mL,与普通PCR方法检测结果相当。结论 HDA法检测志贺菌具有特异、灵敏及仪器要求低等特点,具有广阔的应用前景。     

环介导等温扩增技术应用于口岸病原体快速检测的现状及展望

环介导等温扩增技术由于不需要专业仪器,操作简便,价格便宜,被广泛应用于口岸多种病原体的快速检测.此文总结了环介导等温扩增技术在检测结核分枝杆菌、寨卡病毒、登革热病毒、疟原虫及肝炎病毒等方面的最新研究成果,并对其在口岸快速检测方面的应用前景进行综合分析.     

血液病念珠菌感染基因扩增检测技术建立及临床应用

目的 针对血液病真菌感染日益严重趋势，建立念珠菌基因扩增技术并应用于临床。方法 本研究应用Lyticase破真菌壁提取DNA，采用二对引物分别对白色念珠菌EO3 125bpDNA和念珠菌细胞色素P450 L1A1 243bpDNA进行基因扩增；并分别对白色念珠菌标准株、临床样本株、其他念珠菌和不同细菌菌株进行基因扩增特异性比较，同时应用该技术检测血液病患者痰液和血液中念珠菌。结果 基因扩增显示EO3 125bpDNA只有标准株和临床样本白色念珠菌阳性，细胞色素P450 L1A1 243bpDNA具有念珠菌种的特异性，临床血液和痰液标本检测阳性率显著提高，与临床病情一致。结论 血液病念珠菌感染基因扩增技术敏感性、特异性显著增强，而且耗时显著缩短，临床应用取得良好效果。     

乳腺癌扩增基因1与上皮细胞钙黏蛋白在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的 检测乳腺癌扩增基因1(AIB1)与上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)在卵巢癌组织中的表达,并确定其表达与卵巢癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学EnVision二步法染色检测50例卵巢癌组织和13例正常卵巢组织中AIB1、E-cadherin、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)与Ki-67等的表达.结果 卵巢癌组织中AIB1阳性表达率[68％(34/50)]显著高于正常卵巢组织[8％(1/13)](P＜0.01),E-cadherin表达下调率为60％(30/50).AIB1阳性表达率在国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P=0.036),有淋巴结转移高于无淋巴结转移(P=0.027),Silverberg分期G3期高于G1+G2期(P=0.003),浆液性腺癌高于非浆液性腺癌(P=0.049),ER阳性高于ER阴性(P=0.000),Ki-67阳性高于Ki-67阴性(P=0.009);E-cadherin表达下调率在FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P=0.044),浆液性腺癌高于非浆液性腺癌(P=0.002),ER阳性高于ER阴性(P=0.021),Ki-67阳性高于Ki-67阴性(P=0.035).AIB1与E-cadherin表达呈负相关(P=0.026).结论 卵巢癌组织中AIB1与E-cadherin表达情况及临床分期密切相关,可能是参与卵巢癌发展的重要分子.