反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的 探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法 对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA，用巢式PCR外侧下游引物进行反转录，以反转录产物为模板，进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMDl8-T载体后进行测序鉴定。结果 被检样品扩增出特异片段，经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论 反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列，证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段.方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒.提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第1次、第2次PCR.PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定.结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒.Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异.结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法.     

新型冠状病毒与实时荧光RT-PCR核酸检测

新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种最新发现的冠状病毒新毒株,可引起人新型冠状病毒性肺炎,现已证实为一种急性呼吸道传染病,以发热、乏力、干咳为主要表现,严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。目前,临床诊断主要依据流行病、临床表现、实验室检查和胸部影像学,而实验室检查中的实时荧光RT-PCR核酸检测对新型冠状病毒的确诊尤为重要。本文就新型冠状病毒的病原学特点及其与实时荧光RT-PCR核酸检测间的关系进行综述。     

RT-PCR对SARS患者粪便SARS冠状病毒RNA的连续测定及其临床意义

目的采用RT-PCR方法,观察SARS冠状病毒(SARS-associatedcoronavirus,SARS-CoV)在SARS患者粪便中的排出状况。方法以2003年5月16日至23日在本院住院的46例临床确诊SARS患者为研究对象,连续留取粪便标本共103份,提取RNA后采用14对SARS-CoV特异性引物,对每份标本同时进行7次套式RT-PCR扩增,只要有1次RT-PCR结果阳性即判定该标本为阳性。结果在46例患者中,有17例(37.0%)患者的粪便SARS-CoV套式RT-PCR扩增结果为阴性,29例(63.0%)为阳性。粪便SARS-CoVRT-PCR结果阳性时SARS患者的病程为(31.76±10.78)d(12～64d),其中最长1例为64d,系2次连续留取的粪便标本均为阳性、每次标本用2个不同引物RT-PCR扩增结果均为阳性。结论SARS-CoV在患者粪便中排出的时间可长达发病后64d,平均32d,对SARS患者恢复期的消毒隔离应该予以足够的重视。     

采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

Realtime-PCR动态检测巨细胞病毒在肾移植术后的临床应用

目的探讨巨细胞病毒(C M V)D N A检测在肾移植术后C M V病预防中的作用。方法采用R ealtim e-PC R定量检测肾移植受者外周血白细胞中C M V-D N A,术后4月内每周1次。结果95例患者中有55例检出C M V-D N A阳性(57.9%),初次检出C M V-D N A的平均时间为(25.6±16.3)d,C M V-D N A的平均拷贝数为(1396.4±445.2)/105白细胞。在随访过程中,18例患者的C M V-D N A水平超过警戒线—800copy/105白细胞,经调整免疫抑制剂后,均降至警戒线以下,所需平均时间为(16.3±8.5)d。所有患者均未出现C M V病。结论C M V-D V A检测可用于预防肾移植术后C M V病的发生。     

实时荧光聚合酶链反应技术在病原体检测方面的应用

聚合酶链反应（PcR）已经成为分子生物学实验室的重要工具，实时荧光聚合酶链反应技术以其定量准确、敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一大步。本文对其目前在临床常见细菌或病毒检测中的主要应用进行综述。     

应用RT-PCR检测CK19在乳腺癌前哨淋巴结表达的临床研究

目的：评价RT—PCR检测细胞角蛋白（CK19）在乳腺癌前哨淋巴结中的表达，提高前哨淋巴结活检及其微转移检测的敏感性及准确率。方法：随机选取2005年12月至2006年10月住院的乳腺癌患者66例，采用美蓝进行SLN识别。对其中40例同时应用RT—PCR法检测CK19 mRNA在前哨淋巴结（SLN）表达。结果：SLN识别成功63例，成功率为95．5％（63／66）。对40例SLN转移常规病理诊断的敏感度42．9％（9／21），假阴性57．1％（12／21），准确率70．0％（28／40）。在行RT—PCR检测的40例中，检测出常规病理未检出的微小转移病例12例，敏感度95．2％（20／21），假阴性4．8％（1／21），准确率97．5％（39／40）。两组统计学差异有显著性。结论：前哨淋巴结活检可有效判断乳腺癌腋淋巴结转移状态，应用RT—PCR检测CK19 mRNA在SLN的微转移，可提高敏感度及准确率。     

RT-PCR检测汉坦病毒的感染

目的：探讨逆转录-聚合酶链庄应（RT-PCR）检测汉坦病毒（Hantaviru，HV）感染的准确性和敏感性。方法：以陈株汉坦病毒感染培养的Vero-E6细胞和小鼠乳鼠，用RT-PCR和免疫荧光（immunofluorescence，IF）的方法分别予以检测。结果：RT-PCR和IF对病毒感染细胞的检测结果均为阳性，8只接种病毒的乳鼠肺组织RP-PCR检测均为阳性，而免疫荧光检测仅5例阳性。结论：RT-PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法，其敏感性高于IF。     

Wilms瘤基因WT1 mRNA的FQ-RT-PCR定量分析研究

[目的]探讨WT1mRNA在Wilms瘤表达的临床意义及其与Wilms瘤生物学性状的关系.[方法]对22例Wilms瘤、瘤旁肾组织及血液标本行WT1 mRNA FQ-RT-PCR定量检测.用SPSS软件进行统计学检验,分析.[结果]肿瘤组织中WT1mRNA表达显著高于肾组织和血液,与年龄、性别、BWT或UWT无关.UH型高于FH型,而肾组织表达又较血液高,BWT血中WT1mRNA表达高于正常对照组及UWT组,而UWT与正常表达无差别.[结论]Wilms瘤基因WT1mRNA表达与Wilms瘤发生发展存在关联,且与肿瘤的病理及预后相关,表达越高病理类型及预后越差,但与WT患儿的年龄、性别、BWT或UWT无关.血WT1mRNA表达水平可能作为BWT的诊断或高危筛选指标.     

应用多聚酶链反应检测肺炎支原体

参考Ｂｅｒｎｅｔ法合成引物一对，建立肺炎支原体ＤＮＡ的多聚酶链反应检测法，靶ＤＮＡ为１４４ｂｐ。特异性试验显示仅肺炎支原体呈阳性。敏感性试验显示≥１１３ｃｆｕ肺炎支原体呈阳性。检测３０例临床疑似肺炎支原体肺炎患儿的咽拭子，肺炎支原体ＤＮＡ阳性率８０％，１０例健康小儿咽拭子均呈阴性，全部操作可在２４ｈ内完成。     

应用套式PCR检测嗜肺军团杆菌的实验研究

应用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测１￣６型嗜肺军团杆菌，两轮ＰＣＲ都分别出现了９９６ｂｐ和６５０ｂｐ的特异性扩增产物；而金黄色葡萄球菌等七种细菌均未出现特异性扩增。两轮ＰＣＲ分别可以检测１０ｐｇ和１０ｆｇ的模板ＤＮＡ。８份嗜肺军团杆菌含量分别为１￣１０＾７ｃｆｕ／ｍｌ的痰感染模拟标本均出现了特异性扩增产物。提示该方法可用于临床，特别是检测含微量嗜肺军团杆菌的临床标本。     

聚合酶链反应检测无菌性体液中真菌

目的：评价聚合酶链反应（PCR）直接检测无菌性体液中真菌结果可靠性。方法：采用真菌通用引物，通过PCR对96份临床无菌性体液扩增菌DNA，同时对这些标本进行细菌、真菌培养。结果：PCR诊断无菌性体液真菌感染与培养法完全一致，培养出细菌的标本PCR检测真菌PCR检测真菌DNA均阴性。结论：PCR直接检测无菌性体液中真菌敏感、特异、快速、准确，但不能代替培养法。     

用聚合酶链反应检测咽拭子和痰液中的肺炎支原体

采用聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｐ）特异的１４４ｂｐＤＮＡ片段，并将ＰＣＲ扩增与常规培养或血清冷凝集素测定相比较。结果表明，该法的阳性率明显高于常规培养或冷凝集素测定。２５例患者标本常规培养阳性６例（２４．０％），ＰＣＲ扩增阳性１１例（４４．０％），５０例患儿咽拭子ＰＣＲ扩增阳性１５例（３０．０％），其中２７例同时进行了ＰＣＲ和血清冷凝集素测定，阳性率分别为４０．７％（１１／２７）和２５．９％（７／２７）。ＰＣＲ扩增阳性病例改用红霉素或四环素治疗均获显著疗效。本法具有快速、特异、灵敏度高等优点，可望成为早期诊断Ｍｐ感染的常规方法。     

用套式PCR诊断肺炎支原体感染

应用套式PCR检测患儿咽部分泌物中的肺炎支原体（MP），阳性率为44．4％（28／63），比单式明显增高，由于两次扩增，增强信息量，增除生殖道支原体的假阳性，排除了其他干扰，提高检测的特异性、敏感性。     

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的：探讨多重半巢式聚合酶链反应（msnPCR)在研究巨细胞病毒（CMV）DNA多聚酶基因（UL-54）中的应用价值。方法：从8例心肺移植患者血标本中提取DNA,以CMV-UL54为模板,自行设计6条特异性引物,建立msnPCR扩增系统。扩增产物在DNA测序仪上自动测序。结果：msnPCR能扩增出427bp和1052bp两条目的片段,扩增产物测序表面存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论：msnPCR扩增结合测序,可检测CMV-UL54的7个功能区目片段中的碱基突变,msnPCR比普通PCR更加省时和经济。     

PCR技术检测孕妇外周血中胎儿细胞的研究

根据Ｙ染色体序列特点，含有Ｙ染色体特异重复ＤＮＡ族（ＤＹＺ１）８００～５０００拷贝、新设计一对引物Ｙ３、Ｙ４经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增该序列的特定片段，来检测孕妇血中胎儿细胞。作者用此方法扩增各妊娠早、中、晚孕妇外周血标本粗提ＤＮＡ，检测男性胎儿细胞，与相应的绒毛、羊水及娩出胎儿性别相比较，符合率分别为９３％、１００％、８７．５％。本研究为无创伤性产前诊断提供了新的途径。     

柯萨奇B组病毒逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

根据柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）基因组５’非编码区核苷酸序列，选用了一对组特异性引物，用于逆转录聚合酶链反应检测ＣＢＶ－ＲＮＡ。结果显示该法可检出ＣＢＶ１～６型ＲＮＡ，灵敏度为１０ＰＦＵ，不能检出其他病毒ＲＮＡ。采用的碘化钠－异硫氰酸胍－氯仿法提取ＣＢＶ－ＲＮＡ与传统的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿法及异硫氰酸胍－酚－氯仿法比较，具有快速、简便、稳定、可靠的特点。应用该法检测ＣＢＶ－５感染鼠外周血ＲＮＡ，第３ｄ即为阳性，提示本法可用于ＣＢＶ感染的早期诊断