PCR直接扩增与套式扩增用于HLA—DR基因分型的研究

人类ＨＬＡ抗原分型在人类学、法医学、疾病易感性及器官组织移植等研究中有重要的意义。在骨髓移植中，进行供者、受者ＨＬＡ配型，选择相合的供体，减少ＧＶＨＤ发生，是移植成功的关键。     

特异性寡核苷酸探针检测胰岛素依赖型糖尿病病人HLA－DR基因频率

为了探讨ＨＬＡ－ＤＲ基因在胰岛素依赖型糖尿病（ＩＤＤＭ）发病机制中的作用，利用聚合酶链反应技术及３０个特异性寡核苷酸探针检测３２例中国北方汉族ＩＤＤＭ病人及２５５名正常中国北方汉族人的ＨＬＡ－ＤＲ基因频率的分布。结果ＩＤＤＭ组ＤＲ３和ＤＲ４频率分别为２５．０％和４０．６％，明显高于正常组（８．６％和１８．６％），ＤＲ３和ＤＲ４的相对危险率分别为３．５ｌ和３．１０。提示ＤＲ３、ＤＲ，与ＩＤＤＭ易感性呈正相关。     

HBV－DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡＣ基因区的一对外引物（ＨＢＣ＿１和ＨＢＣ＿２，扩增片段长度为５６６ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ＿３和ＨＢＣ＿４，扩增片段长度为３０１ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、材异，与分子杂交的灵敏度相当。     

半套式PCR扩增人抗体基因以增加抗体库的多样性

用重链５’－末端８条引物和３’末端１条引物以及轻链５’末端９条引物和３’末端２条引物ｃＤＮＡ为模板对免疫球蛋白基因进行了ＰＣＲ扩增。结果表明，重链的扩增率为５０％，轻链的扩增率为４４％。而先用信号肽序列为经物和以上３’末端引物以ｃＤＮＡ为模板先进行第一次ＰＣＲ，然后以该产物为模板再用以上方法进行第二次ＰＣＲ时，不仅所有的引物都佑欣?     

用PCR－F、PCR－SSCP对骨髓移植植入状态的观察

应用ＨＬＡ－ＤＱＡ、ＤＲＢ、ＤＰＢ、ＤＱＢ位点聚合酶链反应一指纹图（ＰＣＲ－Ｆ）和聚合酶链反应一单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法，对５例ＨＬＡ血清学配型一致的异基因骨髓移植病人，分别于移植后３５ｄ左右进行了植入状态的观察。此方法不受供、受体性别和血型的影响，具有灵敏、准确、快速、简便等优点，其中４例以特殊带型为异基因骨髓移植提供了直接的植入证据．     

多次成分血输注致HLA基因分型结果无法判定1例

目前临床用血多为成分输血,成分血分离自全血,不可避免会残留少量白细胞或血小板。而有核细胞或血小板表面存在的HLA会随着输血进入患者体内,异体HLA抗原可对患者的HLA分型判定产生干扰。现报道1例接受过多次大量成分血输注治疗的重型再生障碍性贫血患者,由于未严格按HLA分型血标本规定时间间隔进行血标本采集,导致HLA低分辨基因分型结果无法判定,提示临床医师引起重视。     

用三甲基甘氨酸克服G+C丰富靶基因的PCR扩增困难

为探讨三甲基甘氨酸等有机溶剂对G＋C碱基丰富基因PCR扩增困难的影响，分别用标准PCR和添加有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺及三甲基甘氨酸的改进剂PCR对G＋C含量为70％的周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（ARF）和G＋C含量为90％的胰岛素样生长因子受体Ⅱ（IGFRⅡ）进行扩增。结果显示，应用标准PCR及添加有甘油或甲酰胺的PCR均不能特异性扩出上述两基因；加入10％DMSO虽可扩出ARF基因但同时有非特异性产物；而加入三甲基甘氨酸可特异地扩增出642bp的ARF和540bp的IGFR Ⅱ基因。表明三甲基甘氨酸可消除G＋C丰富DNA区域二级结构对PCR扩增的干扰，明显促进这类基因的PCR扩增。     

CD14基因多态性与严重烧伤患者预后及人白细胞抗原DR表达的相关性研究

目的 探讨CD14基因多态性与大面积烧伤患者预后及人白细胞抗原-DR（HLA—DR）表达的相关程度。方法 采集103例烧伤体表总面积〉30％患者血标本，通过聚合酶链反应-限制性片断长度多态性方法检测CD14—159C／T基因多态性。采用流式细胞技术（使用QuantiBRITE^TM Anti—HLA—DRPE＊Anti—Monocyte PerCP—Cy5．5单克隆抗体）对患者烧伤后1，3，5，7，14，21，28d单核细胞表面HLA—DR抗体的结合量进行定量分析。结果 在特重度烧伤患者中（71例），CD14基因多态性携带TT型的患者脓毒症发生率（72．2％）及死亡率（50．0％）高于TC基因型（分别为60．9％、23．9％）和CC基因型（分别为57．1％、28．6％）（P〈0．05）。特重度烧伤患者中脓毒症组（45例）HLA—DR结合抗体量伤后逐步下降，而非脓毒症（26例）组伤后第5天以后持续升高，伤后第3，7，14，21，28d两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。伤后3，14，21d，CC纯合子患者HLA—DR抗体结合量均明显高于TT纯合子（P〈0．05），而与TC型比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 CD14—159C／T多态性与严重烧伤后并发脓毒症及患者预后有关，TT纯合子可能是特重烧伤后机体免疫应答反应异常的相关“易感基因”之一。     

多重PCR同时检测粪便中的志贺菌、侵袭性大肠埃希菌和O－1群霍乱弧菌的致病基因

本研究建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增志贺菌、侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因和Ｏ－１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。对一组经常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻病人粪便标本检测后，ＰＣＲ法有２４例检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２例为非Ｏ－１群；对另一组５６例粪标本亦进行了检测。本方法具有简便、快速、特异、经济和不须培养等特点，宜于临床应用。     

HLA基因多态性与慢性粒细胞白血病的关联性研究

目的探讨人类白细胞抗原（HLA）基因多态性与慢性粒细胞白血病（CML）的关联性。方法采用聚合酶链反应序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术对234例CML患者以及1370例无血缘关系健康对照者进行HLA-A/B/C/DRB1/DQB1基因分型,采用病例对照研究方法进行基因频率、单倍型频率以及疾病发生相对危险度（RR）的研究。结果 CML患者中HLA-Cw3及Cw7的基因频率较对照组显著升高（P〈0.05）,其RR分别为1.4777和3.0595。而HLA-Cw4基因型频率则显著降低（P=0.0020）,其RR为0.4331。扩展单倍型A2-B51-Cw14-DR9-DQ9与A11-B13-Cw3-DR12-DQ07的频率亦有显著性差异（P〈0.05）,其RR分别为3.1027和3.1606。两位点单倍型A2-Cw3、A24-Cw3、B15-Cw1与B40-Cw3的频率也存在显著性差异（P〈0.05）,其RR分别为2.5574、2.2544、3.8587及1.6853。结论通过大样本量的病例对照研究HLA基因多态性与CML之间的关联性探讨取得了初步结果：HLA-Cw3及Cw7与CML的易感性相关;HLA-Cw4则与CML发生呈负相关,可能是CML的保护性基因;某些HLA单倍型或扩展单倍型亦与CML的发生有关。     

HLA基因序列电泳多态性分析及其在骨髓移植中的应用

利用聚合酶链反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术建立了一套人白细胞抗原配型技术，包括ＨＬＡ－ＤＲ单链构象多态性，异二聚体分析和ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ－ＤＮＡ链构象多态性分析技术。对６３例骨髓移植供，受体进行了分析，其中经血清学确定为ＨＬＡ相合的１５对ＰＣＲ－ＳＣＰ分析完全相合；５对因病人血细胞数目和功能异常而供，受体血清不方法无法分型，ＰＣＲ－ＳＣＰ分析确定３对相合，２对不相合，病人临床缓解后重复血清学ＨＬＡ     

富含GC DNA PCR扩增条件的优化

目的 :探索富含GCDNA的PCR扩增条件 ,为大环内酯类化合物组合生物合成中模块和酶域的任意组合奠定基础。方法 :在PCR扩增体系中 ,添加甲酰胺、甘油、二甲亚砜 (DMSO)、Mg2 等增强剂 ,并选择合适的扩增体系 ,优化富含GCDNAPCR扩增条件。结果 :甲酰胺对富含GCDNAPCR扩增没有影响 ,而甘油和DMSO均可提高富含GCDNAPCR产物的特异性和产率 ,以 5 %～ 10 %DMSO效果最好。使用Roche长片段DNA扩增系统 ,在使用缓冲液 2反应体系中添加 10 %DMSO和提高 0 .2 5mmol LMg2 浓度时 ,可以扩增长度为 5kb、GC含量为 73%的DNA片段。结论 :应用优化的PCR扩增条件 ,可以扩增长达 5kb富含GC的DNA片段 ,可以满足大环内酯类组合生物合成模块和酶域随意组合的需求     

普通PCR与TD-PCR在临床医学科研中应用价值的比较

目的 比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR,TD-PCR)在临床医学科研中的价值.方法 以人类外周血基因组DNA为模板,设计VHL基因3个外显子的3对引物,根据普通PCR及TD-PCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序,通过试验选择PCR最佳反应条件,在同一程序中分别对3个片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,纯化后PCR产物测序分析两种试验方法 的差别.结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TD-PCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高.结论 成功建立了TD-PCR方法 ,TD-PCR方法 较普通PCR更为高效实用,为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段.     

Forensic casework methodology for direct PCR amplification of blood swabs

1. Download : Download high-res image (120KB)
2. Download : Download full-size image

     

3种基于PCR的荧光标记方法的比较研究

目的：荧光标记物是目前杂交型基因芯片所检测的主要目标底物，本实验比较了3种基于PCR的荧光标记方法在基因芯片检测中的应用效果。方法：荧光分子标记的引物或荧光分子修饰的核苷酸可以在PCR反应中通过Taq，Pfu等DNA聚合酶掺入到PCR产物中，在此过程中，荧光分子又可以通过不同的方法掺入到PCR产物中。方法1：直接将荧光分子化学合成在引物的5’端；方法2：在PCR反应体系中加入荧光分子修饰的核苷酸单体，由DNA聚合酶将其掺入PCR产物中；方法3：对PCR产物通过非模板依赖性的酶促加尾反应在其3’端随机加入荧光修饰的核苷酸。本实验优化了3种荧光标记方法，并以检测CYP3A4基因外显子5中4个核苷酸位点的探针微阵列为例，比较了检测效果。结果：在各自优化的实验条件下，从扩增、标记效率以及芯片杂交的信号强度、背景、分辨率等方面进行比较，3种方法得到的荧光标记样品无明显区别，但后两种方法操作过程复杂，使用成本高，对反应条件苛刻。结论：3种基于PCR扩增的荧光标记方法均可以提供优质的荧光标记探针或样品(底物)，在实际应用中，各自有不同的特点及适用范围。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值〈15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值<15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

梭菌属神经毒素的基因鉴定与分型

目的:建立梭菌属神经毒素基因快速鉴定和分型的PCR方法。方法:根据GenBank提供的肉毒毒素及破伤风毒素基因序列,综合应用多种生物学软件与在线分析平台,设计特异性及通用检测引物,对各型梭菌属毒素基因进行PCR扩增,验证扩增反应的特异性、通用性、灵敏度及重复性。结果与结论:设计了针对A,B,E,F型肉毒毒素、破伤风毒素基因轻链毒性活性区的5对特异引物,以及重链跨膜区和结合区的一对通用引物(BonAB-P01/P02,BonB-P01/P02,BonE-P01/P02,BonF-P01/P02,TET-P01/P02,TY-P01/P02)。对各型神经毒素进行特异性扩增并在型间进行交叉实验,检测特异性良好,没有交叉反应;通用扩增结果显示均得到1 100 bp大小的条带。目前此检测方法灵敏度可达到(1~3)×103个菌。该检测方法特异性强,灵敏度高,可以用于梭菌属神经毒素基因的快速筛查与鉴定分型。     

创伤伤口分泌物中产气荚膜梭菌快速定量检测方法的建立及应用

目的 建立检测创伤伤口分泌物中产气荚膜梭菌的实时荧光定量PCR方法,为气性坏疽的早期快速诊断提供新手段.方法以产气荚膜梭菌16S rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物及探针,以PCR扩增产物重组质粒作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.对荧光定量PCR体系和反应条件进行优化,并验证方法的特异性、敏感性、重复...     

Rapid and direct detection of male DNA by recombinase polymerase amplification assay

Screening of male DNA is important in forensic investigations, especially sexual assault cases. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) is widely used for the detection of male DNA. However, the use of this technique as a screening tool is time-consuming and labor-intensive. In this study, we established a recombinase polymerase amplification (RPA) assay targeting the multicopy loci on the Y-chromosome for the rapid detection of male DNA (referred to as Y-RPA). The Y-RPA assay was able to detect male DNA in less than 20 min with a sensitivity of 0.025–0.005 ng/µL. Additionally, the Y-RPA assay was highly tolerant to inhibitors; male DNA was detectable in the presence of up to 1000 ng/µL humic acid, 250 µM indigo carmine, and 500 µM hematin. Then, considering its tolerance to inhibitors, we examined the feasibility of the direct Y-RPA assay. The alkaline lysis protocol (addition of sodium hydroxide and heating at 95 °C for 5 min) was employed for preparing the DNA template. The Y-RPA assay successfully detected male DNA using crude DNA extracted from blood, saliva, and semen samples. This approach enabled the screening of male DNA within approximately 30 min (5 min for lysis and 20 min for Y-RPA). These findings suggest that the Y-RPA assay is a promising screening tool for the rapid, simple, and efficient detection of male DNA.