离体培养条件下氟与硒对毛囊影响的初步研究

目的:观察氟与硒对离体培养条件下的人头皮毛囊生长的影响。方法:在离体人头皮毛囊培养模型中,加入不同浓度的氟化钠和亚硒酸钠,目镜测微器测量毛囊长度的变化;连续观察毛囊形态学改变并做电镜切片检查。结果:1mmol/L和10mmol/L的氟化钠能不同程度的抑制离体毛囊的生长(P<0.05)。0.01mmol/L的亚硒酸钠对1mmol/L氟化钠毒性有拮抗作用(P<0.05)。0.1mmol/L氟化钠单独作用对毛囊生长无影响(P>0.05),0.1mmol/L氟化钠及0.01mmol/L亚硒酸钠共同作用对毛囊生长无影响(P>0.05)。电镜观察发现10mmol/L氟化钠作用的毛囊在培养5天时即可见较为严重的凋亡前改变及凋亡现象,10mmol/L氟化钠加0.01mmol/L亚硒酸钠组毛囊也可见到类似的改变,培养9天时还可见到细胞内有空泡,连接紊乱,桥粒连接破坏等现象。结论:不同浓度的氟化钠对游离的人头皮毛囊的生长有不同作用,一定浓度的亚硒酸钠能拮抗氟化钠对毛囊的毒性作用。     

雄激素与体外培养的人毛乳头细胞和外根鞘细胞相互作用的研究

目的观察不同浓度雄激素(睾酮)对体外培养人毛乳头细胞和外根鞘细胞增殖活性的影响。方法采用脱发和非脱发成人头皮标本,用胶原酶消化法分离毛乳头,在角质形成细胞无血清培养基上,对其进行体外培养。采用非脱发成人头皮标本,组织法培养毛囊外根鞘细胞。然后将不同浓度睾酮加入两种毛乳头细胞与外根鞘细胞的共同培养基中,比较其对外根鞘细胞的增殖活性的影响。结果不同浓度睾酮对单独培养的两种毛乳头细胞和外根鞘细胞的增殖性均无作用(与对照组相比P>0.05)。10-9ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与非脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,可促进外根鞘细胞增殖。而10-10ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-9ml/L浓度、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,对外根鞘细胞出现增殖抑制作用。结论睾酮对外根鞘细胞的影响,与其剂量和毛乳头细胞的存在有关。在这个过程中,毛乳头细胞可能起介导作用。     

雄激素与体外培养的人毛乳头细胞和外根鞘细胞相互作用的研究

目的观察不同浓度雄激素(睾酮)对体外培养人毛乳头细胞和外根鞘细胞增殖活性的影响.方法采用脱发和非脱发成人头皮标本,用胶原酶消化法分离毛乳头,在角质形成细胞无血清培养基上,对其进行体外培养.采用非脱发成人头皮标本,组织法培养毛囊外根鞘细胞.然后将不同浓度睾酮加入两种毛乳头细胞与外根鞘细胞的共同培养基中,比较其对外根鞘细胞的增殖活性的影响.结果不同浓度睾酮对单独培养的两种毛乳头细胞和外根鞘细胞的增殖性均无作用(与对照组相比P>0.05).10-9 ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-8 ml/L浓度、10-7 ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与非脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,可促进外根鞘细胞增殖.而10-10 ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-9 ml/L浓度、10-8 ml/L浓度、10-7 ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,对外根鞘细胞出现增殖抑制作用.结论睾酮对外根鞘细胞的影响,与其剂量和毛乳头细胞的存在有关.在这个过程中,毛乳头细胞可能起介导作用.     

阿仑膦酸钠、氟化钠联合作用对体外培养大鼠成骨细胞的影响

目的探讨阿仑膦酸钠联合氟化钠对体外培养大鼠成骨细胞的作用。方法采用酶消化法分离SD大鼠颅盖骨中成骨细胞,原代培养。分别给予不同浓度的阿仑膦酸钠和氟化钠分组刺激,观察药物对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响,并用Western Blot法测定骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子-B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-B ligand,RANKL)蛋白表达。结果阿仑膦酸钠最佳单药浓度为10~(-6) mmol/L,氟化钠的最佳单药浓度为10~(-8) mmol/L,两种药物最佳浓度联合应用更能促进成骨细胞增殖,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性更强,OPG表达升高、RANKL表达下调,与对照组相比,差异有统计学意义。高浓度氟化钠(10~(-3)mmol/L、10~(-4)mmol/L)对成骨细胞有抑制作用。结论阿仑膦酸钠、氟化钠低浓度时均促进成骨细胞增殖和分化,二者联合有协同作用。高浓度氟化钠对成骨细胞有抑制作用。     

游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查的实验研究

目的：构建游离毛囊体外培养模型，观察离体培养人头皮毛囊形态变化。方法：在Williams E无血清培养基中，建立离体人头皮毛囊培养模型；通过倒置显微镜观察毛囊的形态变化；目镜测微器测量毛囊长度；3H-TdR掺入检测毛囊DNA合成率；组织学检测用冰冻切片光镜观察和电镜切片透射电镜观察。结果：毛囊有不同程度的生长，随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊；冰冻切片HE染色后在光学显微镜下可清楚分辨出毛囊的结构；培养3天毛囊的内外根鞘中可见凋亡细胞，内皮根鞘较外皮根鞘明显多见。结论：在离体培养人头皮毛囊时，Williams E无血清培养基是合适的选择，该模型也是筛选促进或抑制毛发生长药物的良好模型；离体培养毛囊组织学检测用冰冻切片可以简化步骤；透射电镜可以用来观察离体培养的毛囊的形态和超微结构的变化，也可以用来协助观察细胞凋亡的状况。目镜测微器测量毛囊长度简单可行，辅以3H—TdR掺入则更为客观。     

硒抑制长链非编码RNA HOXB-AS1表达调控胃癌增殖的作用及其机制

目的探讨硒抑制长链非编码RNA HOXB cluster antisense RNA1(HOXB-AS1)表达调控胃癌增殖的作用及其机制。方法对人胃癌HGC-27、SNU-1, KATO Ⅲ细胞和人胃黏膜上皮细胞使用实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内HOXB-AS1基因表达水平;根据亚硒酸钠添加的浓度将高表达HOXB-AS1基因的细胞分为空白组、5 μmol/L组、10 μmol/L组、15 μmol/L组、20 μmol/L组、25 μmol/L组、30 μmol/L组, 分别培养24、48、72 h后采用细胞计数试剂(CCK-8)检测各组细胞活力, 筛选亚硒酸钠的最佳作用浓度;用30 μmol/L亚硒酸钠干预人胃癌HGC-27细胞, 采用RT-qPCR检测细胞内HOXB-AS1基因表达水平, 采用CCK-8检测细胞活力, 采用流式细胞术检测细胞凋亡比例变化, 运用蛋白质印迹法(Western blot)法检测蛋白激酶B(Akt)及雷帕霉素的哺乳动物靶标蛋白(mTOR)的表达水平。组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。结果 RT-PCR检测结果表明, 与其他细胞...     

角蛋白在头皮中的分布及其在干细胞研究中的意义

目的：研究不同类型角蛋白（Cytokeratin，CK）在头皮及毛囊结构中表达分布情况。方法：将头皮病理切片和游离培养的毛囊使用不同类型角蛋白抗体进行免疫组化染色，检测角蛋白的分布情况。结果：CK15主要分布在毛囊隆突部，部分毛囊外根鞘最外层也有一定的表达；CK19主要分布在汗腺、毛囊外根鞘最外层和皮肤的基底层；CK16在表皮层和毛囊外根鞘均有阳性表达；CK10主要分布在头皮表皮的基底上层和皮脂腺腺泡的最外层。结论：不同类型角蛋白在头皮和毛囊结构中具有明显差异性，CK19和CK15阳性表达细胞可能具有干细胞特性。     

不同浓度胰岛素对毛乳头细胞的生物学作用的研究

目的：了解不同浓度胰岛素对毛乳头细胞的生物学作用。方法：人头皮组织分离、培养、获得毛乳头细胞,根据胰岛素浓度分为1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol/L3个组,设无胰岛素培养液为对照组。应用不同浓度胰岛素的2%新生牛血清培养液培养毛乳头细胞3天,分别用MTT法测定毛乳头细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定毛乳头细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果：与对照组比较,1×10^-8、1×10^-7mol/L胰岛素组毛乳头细胞增殖、抗凋亡及迁移能力显著增加（P〈0.05或P〈0.01）,且1×10^-7mol/L组作用最强（P〈0.05或P〈0.01）。结论：1×10^-8～1×10^-7mol/L胰岛素可以增强毛乳头细胞增殖、迁移和抑制凋亡的作用。     

胎儿头皮毛囊内黑素细胞HMB-45和NKI/beteb的表达

目的：观察黑素细胞在胎儿头皮内的定位。方法：获取胎儿头皮（胎龄7月,畸形引产,死亡2h）,制备冰冻切片,分别用HMB-45和NKI/beteb抗体进行免疫荧光染色和免疫组化染色,激光共聚焦显微镜和倒置显微镜观察摄片。结果：NKI/beteb阳性细胞主要位于胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区,也见于毛球处、表皮基底部。HMB-45阳性细胞主要存在于毛球部、毛母质和表皮基底部,外根鞘区表达则阴性。结论：胎儿头皮毛囊内存在不同状态的黑素细胞,位于毛囊外根鞘隆突区的黑素细胞是黑素母细胞。     

丙氨酰-谷氨酰胺对人结肠癌细胞株增殖活性的影响

目的 研究丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)对人结肠癌细胞株增殖活性的影响。方法 经体外培养结肠癌细胞,加入不同浓度的Ala-Gln后收集细胞,应用流式细胞技术,检测癌细胞的细胞周期及凋亡情况。结果 随着细胞培养液中的浓度从1.0 mmol/L递增至8.0 mmol/L时,细胞凋亡率从8.94％降至3.78％,Ala-Gln浓度与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.880,P<0.01)。加入氟尿嘧啶(5-Fu)后细胞凋亡率从18.01％增至36.01％,Ala-Gln浓度与细胞凋亡率呈直线正相关(r=0.942,P<0.01)。进一步增加Ala-Gln浓度,从10.0 mmol/L递增至45.0 mmol/L时,细胞凋亡率分别为16.89％、15.46％、18.47％、22.08％、18.75％、16.56％、20.89％、15.57％,细胞凋亡率与Ala-Gln浓度变化无直线相关关系。结论 在一定浓度范围内,Ala-Gln可减少结肠癌细胞的凋亡,促进G_0/G_1期的细胞增多,增强化疗药物的作用。     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

人毛囊外根鞘细胞的分离及培养

目的 建立毛囊外根鞘细胞的分离和培养方法.方法 利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用组织块法和消化法进行细胞培养,倒置显微镜、扫描及透射电镜观察细胞形态,培养各代细胞做生长曲线,RT-PCR检测干细胞相对特异性标识分子K15和细胞分化标识分子外皮蛋白的mRNA表达情况.结果 组织块法和消化法均能培养出毛囊外根鞘细胞,并可传代培养,组织块法细胞生长慢,不易汇合,消化法细胞增殖快.各代细胞中K15和外皮蛋白mRNA均有表达.结论 消化法适合毛囊外根鞘细胞的体外培养,该方法的建立为进一步分离纯化培养毛囊干细胞奠定了基础.     

Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hair follicles

Hair dermal papilla cells are specialized mesenchymal cells that exist in the dermal papilla located at the bottom of hair follicles. These cells play pivotal roles in hair formation, growth, and cycling. Hair follicle formation is usually directed by an aggregation of dermal mesenchymal cells, the origin of dermal papilla cells, in the embryonic skin. We noticed that cultured dermal papilla cells also have hair-forming activity and do not lose the activity even after long-term cultivation, if they are cultured with conditioned medium from keratinocytes obtained from the sole or with a medium containing fibroblast growth factor. The secreted factors from keratinocytes and fibroblast growth factor are, therefore, important for maintaining the cellular properties of dermal papilla cells. Even if the hair bulb, including the hair matrix and the dermal papilla, has been removed from vibrissal follicles in vivo, the new hair matrix and papilla can regenerate from the rest of the follicle, and eventually a hair shaft regrows. It has been reported that hair bulb regeneration does not occur when the lower half of a hair follicle is removed. However, new hair bulbs were formed in the remaining upper halves of vibrissal follicles if the amputated follicles had been implanted under the kidney capsule. The formed bulbs were small and pelage-type, not large vibrissa-type. Histological studies showed that the new dermal papillae were derived from dermal sheath cells surrounding upper follicular epidermis, and the new hair matrices were produced from the follicular epidermis. Moreover, the upper halves of vibrissal follicles reformed large vibrissa-type bulbs when they were associated with dermal papillae or cultured papilla cells and implanted in the kidney. Thus, dermal papilla cells and probably dermal sheath cells have the ability to induce and form hair bulbs under preferred environmental conditions. Attempts to identify the genes and proteins associated with hair-forming activity of dermal papilla cells have been carried out. We and other groups successfully isolated the molecules that were specifically expressed in dermal papilla cells. The nature of the hair-producing factors could be understood through the studies of these molecules.     

利用毛囊干细胞和成纤维细胞重建全层皮肤的研究

目的建立利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行全层皮肤重建的实验方法.方法取美容手术切取的头皮组织,K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞,消化、分离、体外培养,以胶原-成纤维细胞聚合物为基质,采用气-液界面对第2代毛囊干细胞立体培养14 d,建立全层皮肤培养模型,并行组织学及K1免疫荧光染色观察.结果K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞存在于毛囊外根鞘处,与成纤维细胞联合体外气-液界面立体培养14 d,获得的皮肤类似物,可见真皮基底膜形成,表皮多层上皮有序、多角形排列,上层细胞出现角化,真皮部成纤维细胞均匀分布于胶原基质中,角质细胞形成分化特异标志物K1染色阳性.结论毛囊外根鞘处的毛囊干细胞具有高增殖能力并向表皮细胞分化,可成功利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行皮肤重建,为临床应用奠定基础.     

P物质在表皮干细胞向毛囊迁移分化中的作用

目的 了解P物质（SP）在表皮干细胞（ESC）向毛囊迁移分化中的作用并探讨其机制。方法 将体外培养的ESC以角蛋白19（K19）及β1整合素免疫染色法确认其为所需的ESC。采用5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记ESC，将SP加入已标记的ESC培养液中，根据所加SP的浓度分为10^-5 mol／LSP组、10^-6mol／L SP组、10^-7mol／L SP组。并将加入SP的各组ESC悬液0．3ml注射到裸鼠背部真皮内，于首次注射后4、7、10、14d分别再注射1次，剂量、部位同前。对照组除不使用SP外，其余处理相同。各组于首次注射后28d在无菌条件下取注射区皮肤及远离注射区的正常皮肤组织，行免疫组织化学染色，电子显微镜下观察裸鼠皮肤组织学特点，行皮肤毛囊计数。结果 注射后，10^-5 mol／L SP组可见散在的毛囊，部分毛囊发育不全。10^-6mol／L SP组、10^-7mol／L SP组真皮深层及皮下组织中，可见大量的组织结构清晰的毛囊，部分毛囊的毛根部位可见棕黄色BrdU阳性颗粒，多数毛囊的外毛根鞘部位可见棕黄色β连环蛋白阳性颗粒以及极少量发育不全的毛囊，毛囊计数[（1．9±1．2）、（1．3±0．8）个]均少于对照组[（10．5±1．2）个，P〈0．01]。对照组真皮深层和皮下组织的毛囊发育不全，表皮层中可见棕黄色BrdU阳性颗粒和β连环蛋白阳性颗粒。结论 SP可诱导基底层的ESC向毛囊迁移，其诱导效应与SP浓度有关，并促使ESC内β连环蛋白的表达增高，诱导其向毛囊分化。     

TGF-β各亚型与其受体在猪皮肤及毛囊中的表达

目的：探讨转化生长因子-β的两种异构体（TGF—β1和β2）及其受体（TGF—ORII）在黑毛白皮小香猪皮肤及毛囊中的表达特征。方法：用免疫组化方法确定TGF-D亚型及其受体在黑毛白皮小香猪皮肤及毛囊中的定位和表达量的变化规律。结果：TGF-β蛋白颗粒主要分布于表皮角质形成细胞、生长后期及退行期的毛囊外根鞘和内根鞘细胞,在皮下脂肪细胞中亦有弱阳性表达。TGF—β2的蛋白颗粒在表皮角质形成细胞有阳性表达,在真皮乳头层大部分成纤维细胞和血管内皮细胞中均有强阳性表达。在毛囊的退行期,毛囊外根鞘细胞、毛隆突细胞和结缔组织鞘成纤维细胞中有阳性表达。TGF-β R Ⅱ主要存在于表皮角质形成细胞,在毛囊结缔组织鞘中部分成纤维细胞和外根鞘细胞中有阳性表达,特别是在退行期早期的毛乳头基质细胞、外根鞘细胞中有强阳性表达,在退行中晚期的外根鞘部分细胞中有阳性表达,但明显减弱。TGF-β1、TGF—β2和TGF—β R Ⅱ在猪皮肤中蛋白表达量分别为17．0±2．5,24．2±3．1,13．2±2．9。结论：TGF—D的异构体及其受体主要表达于毛囊生长期晚期和退行期早期,可能在毛囊从生长期向退行期转化的过程中起重要的作用。