携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

肝癌组织特异性小鼠IL—3,TNF逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞…

从ＰＳＶ２３ＳＭＴＮＦ和ＰＳＰＭＯＩＬ－３质粒分别切下小鼠肿瘤死因子和小鼠白细胞介素３（ｍＩＬ－３）ｃＤＮＡ，并切除ｍＩＬ－３ｃＤＮＡ３＇端ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ不稳定序列，以两种细胞因子ｃＤＮＡ作为目的基因，分别克隆到逆转录病毒载体ＰＭＮＳＭ多克隆位，再于目的基因上游分别插入小白蛋白启动子增强子序列，构建成功能两种肝癌组织特异表达性细胞因子逆转录病毒载体，经磷酸钙共沉淀法导入包装细胞ＰＡ３１７中包     

携带HuIL—3基因的人肝癌特异性逆转录病毒转体的构建

构建携带人白细胞介素ｃＤＮＡ的人肝癌特异性闻生转录病毒载体。将ＨｕＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，构建ＳＶ４０早期启动子驱动的载体ｐＭＮＳ－ＩＬ－３；从质粒ｐＧＥＭ，７Ｚｆ－ＡＦＰｅ中游离人甲胎蛋白增强子核心序列，先克隆 到ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点上，     

逆转录病毒介导的人肝癌特异性的HSV—tk／ACV的体外抗肝癌作用

目的；建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果；构建携带单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，用Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交方法证明ＨＳＶ－ｔｋ基因在ＡＦＰ高分泌的ＨｅｐＧ２细胞中得到特异转录，以阿昔洛韦（ＡＣＶ）为前药攻击转基因的肝癌细胞呈示对ＨｅｐＧ２有相对选择性杀伤作用。结论；该Ａ     

携带HuIFN—h0634cDNA的重组逆转录病毒载体的构建及在人肝…

研究逆转录病毒介导干扰素基因转移及在肝癌细胞中特异表达作用。将人β干扰素ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬ位点，分别构建了转录受ＳＶ４０启动子驱动的载体ＭＮＳＩＦＮＢ的转录受人甲胎蛋白增强子调控的载体ＭＮＡＩＦＮＢ。     

逆转录病毒介导的人肝癌特异性HSV－tk／ACV的体外抗肝癌作用

目的：建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果：构建携带单纯疮疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法证明ＨＳＶ－ｔｋ基因在ＡＦＰ高分泌的ＨｅｐＧ２细胞中得到特异转录，以阿昔洛韦（ＡＣＶ）为前药攻击转基因的肝癌细胞显示对ＨｅｐＧ２有相对选择性杀伤作用。结论：该ＡＦＰｅ／ＨＳＶ－ｔｋ／前药转换疗法为肝癌特异性基因治疗提供了有价值的资料。     

人γ干扰素基因真核表达载体pZip—γ干扰素的构建

为构建逆转录病毒载介导的人γ干扰素（ＩＮＦ－γ基因真核细胞表达载体，将质粒ｐＧＥＭ－１－ＩＦＮ－γ用ＢａｍＨＩ酶切，分离回收入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ片段，再定向克隆入逆转录病毒载体ｐＺｉｐ、Ｎｅｏ、ＳＶ（Ｘ）１。经酶切鉴定证实该片段已被正确克隆入ｐＺｉｐ．Ｎｅｏ．ＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ酶切位点，构建成ＩＦＮ－γ基因真核表达载体ｐＺｉｐ－ＩＦＮ－γ。ｐＺｉｐ－ＩＤＮ－γ的构建成功。为开展ＩＦＮ－γ基因     

携带HuIFN－β cDNA的重组逆转录病毒载体的构建及在人肝癌细胞中的特异表达

目的：研究逆转录病毒介导干扰素基因转移及在肝癌细胞中特异表达作用。方法：将人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬ位点，分别构建了转录受ＳＶ４０启动子驱动的载体ＭＮＳＩＦＮＢ和转录受人甲胎蛋白增强子（ＡＦＰｅ）调控的载体ＭＮＡＩＦＮＢ。用脂质体转染法将载体分别转导ＰＡ３１７包装细胞，质粒转染率为每１０５ＰＡ３１７细胞（４～２５）×１０３ＣＦＵ／μｇ，病毒感染率（４．５～５００）×１０４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌、肾癌及黑色素瘤细胞。结果：ＮｅｏＲ克隆ＲＮＡ斑点杂交及ＩＦＮ活性分析证明，人ＡＦＰｅ可促进异源启动子启动ＨｕＩＦＮ－β基因在合成ＡＦＰ的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。结论：ＡＦＰ＂持家基因＂顺式调控序列在合成ＡＦＰ的肝癌细胞中特异驱动ＩＦＮ－β基因表达，该研究为肝癌特异性免疫基因治疗提供了资料。     

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶｔｋ）基因导人恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷（ＧＣＶ）可选择性地杀死肿瘤细胞．本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并切除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞，４８ｈ后，在光镜下观察细胞形态及进行活细胞计数．结果表明，ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因阻断成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法利用构建的含反义Ｎ－ｒａｓ１基因的逆转录病毒质粒（ｆｐＧｖ１－ＭＴ－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮ－ｒａｓ１）转染于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），ｆｐＧｖ１－ＭＴ逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对ｂＦＧＦ诱导的ＶＳＭＣ的影响。结果反义Ｎ－ｒａｓ１细胞数为（１６．８±１．３）×１０４（细胞／ｍｌ），空载质粒对照细胞为（３０．１±１．２）×１０４，两者差异有显著意义（Ｐ＜０．００１）；反义Ｎ－ｒａｓ１细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率为７６４３±６７２（ｃｐｍ），空载质粒对照细胞为１５１３１±１３８（ｃｐｍ），两者差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００１），同时应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因的细胞ＲａｓｍＲＮＡ表达水平明显降低，其表达蛋白ｐ２１也明显降低。结论反义Ｎ－ｒａｓ１基因对ＶＳＭＣ及ｂＦＧＦ诱导ＶＳＭＣ增殖有抑制作用。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

腺病毒载体基因转移系统的建立及其在脑肿瘤中的高效表达

构建了含有ＣＭＶ启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组质粒ｐＡｄＣＭＶｔｋ将其与缺陷型腺病毒Ａｄ５大框架ｐＪＭ１７－一起共转染病毒包装细胞２９３细胞，获得有感染能力但复制缺陷在得组腺病毒ＡｄＣＭＶｔｋ，以其感染大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞后用ＰＣＲ方法证实ＨＳＶ－ｔｋ基因能被腺病毒有效转入靶细胞，用带报告基因ＬａｃＺ的腺病毒感染大鼠Ｃ５脑胶质瘤细胞，经ｘ－ｇａｌ染色，证明腺病毒载体的基因转移效率可达１００％。     

人白细胞介素—15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞？…

目的 观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达,方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ构建ＰＬ－ＩＬ－１５－ＳＭ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果 获得３个ＰＧ     

插入增子后人β—珠蛋白基因在MEL细胞中的表达

将人β－珠蛋白基因（２．４ｋｂ），分别反向克隆入逆转录病毒载体Ｎ２β和Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ３′ＬＴＲ插入４１２ｂｐ的增强子ＨＳＩＩ（简称Ｎ２ＡβＥ０．４）。将此两种逆转录病毒重组质粒分别转入φ－２和ＰＡ３１６细胞，经Ｇ４１８筛选后，用ＰＡ３１７细胞产生的病毒粒子感染小鼠红白血病细胞ＭＥＬ。结果显示，人β－珠蛋白基因可在ＭＥＬ内得到表达，来自人ＨＳＩＩ（４１２ｂｐ）的增强子可以增强人β－珠蛋白基因ｍＲ     

HSV—tk基因反转录病毒载体的构建及体外抗脑肿瘤细胞作用研究

构建了含有ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转病毒载体ｐＬＮＴＫ，ＰＣＲ证实ｐＬＮＴＫｄ成功地转移到ＳＨＧ４４及ＮＢＡ２细胞，体外实验证实，表达ＨＳＶ－ｔｋ细胞对ＡＣＶ的敏感性明显高于未修饰的亲本细胞，ＳＨＧＬＮＴＫ，ＮＡＬＮＴＫ细胞地ＡＣＶ的敏感性分别是其亲本细胞的１０００，５００倍，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法证实转染ＨＳＶ－ｔｋ细胞在ＡＣＶ存在下，其ＤＮＡ合成能力较亲本细胞明显抑制，共培养实验证     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。     

B细胞活化因子B7—1cDNA的克隆及其在白血病细胞的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从ＥＢＶ转化Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ、酶切Ｂ７－１基因和逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，连结、克隆ＰＬＢ７－１ＳＮ到大肠杆菌Ｍｃ１０６１。扩增纯化质粒ＰＬＢ７－１ＳＮ。用ＰＡ３１７细胞包装病毒，ＮＩＨ３Ｔ３细胞筛查病毒滴度，获得高效价的Ｂ７－１病毒上清，病毒感染人白血病细胞株Ｋ５６２和ＨＬ６０，获得稳定表达Ｂ７－１分子的肿瘤细胞。