凝胶过滤层析纯化乳酸脱氢酶同工酶

乳酸脱氢酶 (LDH)广泛存在于生物细胞内。它以NAD+ 为辅酶 ,在细胞代谢过程中起重要的调节作用 ,是最早发现的同工酶之一。近年来随着酶法分析的应用 ,酶促偶联反应不断应用于临床医学及其他研究领域。特别是正确选择以NAD+ 、NADP+为辅酶的脱氢酶做标记酶、工具酶 ,以便准确测定组织中其他一些酶的特性已成为许多人的研究内容[1] 。 2 0世纪 70年代以前常用硫酸盐及有机溶剂分级沉淀 ,然后用离子交换层析分离纯化。这些方法分离周期长、酶活性损失大。近年来也采用亲和层析 ,但需具备一定的条件。本文采用凝胶过滤层析技术 ,建立了一…     

重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶的纯化及免疫活性测定

目的:研究恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白纯化和复性的最佳条件。方法:重组质粒PGEX-4T-1-LDH在E.coli BL21中表达，表达产物用酶裂解法洗涤、变性、复性、Q-Sepharose High Performance离子交换层析方法纯化。结果:获得具有生物活性的蛋白，其纯度达到95％。结论:此方法操作简便，纯化效果好。     

分离乳酸脱氢酶同工酶的琼脂糖凝胶电泳法改进

作者改进了琼脂糖凝胶电泳法用以分离乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同工酶，可以提高电泳分离的效果，避免胶层开裂或脱落，提高扫描曲线的分辨率。     

乳酸脱氢酶同工酶的提取及活力测定

以兔肌为实验材料，常规处理组织均浆，差速离心，取微量上清液经稀释为为酶样品。以丙酮酸，还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物，测定ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的吸光度改变以判定乳酸脱氢酶的活力。     

抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶抑制作用的动力学研究

目的　探讨抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶 (LDHm)活性的影响及其动力学机制。方法　采用分光光度法追踪酶反应 ,用Lineweaver Burk作图法分析动力学机制。结果　在pH7.0、2 5℃、1 0 1 .3kPa条件下求出LDHm 的KmNADH为 2 .2 5× 1 0 - 5mol/L、KmPyr为 1 .55× 1 0 - 4mol/L、VmaxNADH为 0 .1 1 4A340 /min、VmaxPyr为 0 .1 0 7A340 /min。在酶反应体系中 ,不同浓度的抗坏血酸对LDHm 均具有可逆抑制作用 ,并存在量效关系。随抗坏血酸浓度增加 ,表观KmNADH、表观VmaxNADH均逐渐减小 ,而表观KmNADH/VmaxNADH不变 ;表观KmPyr逐渐增大 ,而表观VmaxPyr不变。结论　抗坏血酸相对于NADH为LDHm 的反竞争抑制剂 ,相对于丙酮酸为LDHm 的竞争性抑制剂 ;抗坏血酸结合于E NADH二元复合物从而降低了酶活性     

东方田鼠乳酸脱氢酶同工酶研究

以ＤＢＡ／２小鼠和Ｗｉｓｔａｒ大鼠作对照，用ＴｉｔａｎⅢ醋酸纤维板电泳技术对东方田鼠（Ｍｉｃｒｏｔｕｓｆｏｒｔｉｓ）的血清、红细胞、骨髓、肝、肾的ＬＤＨ同工酶作了分型测定，对电泳酶谱作了光密度扫描，测定各同工酶组分相对活力，并根据ＬＤＨ同工酶分子结构计算了酶分子中Ａ，Ｂ亚基的含量。结果显示：东方田鼠的血清、红细胞、骨髓和肝中仅含ＬＤＨ５，肾中５种ＬＤＨ同功酶组分均存在，以ＬＤＨ５活力最强；ＬＤＨ同工酶分子Ａ、Ｂ亚基含量与其同工酶活力相对应，除肾内Ａ亚基为０．７０、Ｂ亚基为０．３０外，其他组织中均仅含Ａ亚基。     

血清乳酸脱氢酶及其同工酶测定的临床价值

对171例患者及31例健康人血清LDH及其LDHi进行测定,结果发现:患者LDH总活性都普遍升高,LDHi酶谱的变化以AMI及病毒性心肌炎最为显著,其中LDHi分别为43.27%和34.86%,LDH_1/LDH_2都大于1,分别是1.58和1.30,肝炎患者LDH_5升高明显;原发性肝癌LDH总活性升高的同时LDH_5也升高,有的高达34%。     

Anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体的纯化与活性

针对细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）和CXC趋化因子受体4型（CXCR4）两个靶点,设计anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体的基因序列,C末端连接组氨酸标签（6 × His标签）,通过pET-22b（+）重组表达质粒转化大肠埃希菌E.coli BL21,经 IPTG 诱导表达,以可溶性形式存在于菌体裂解上清液。为了提高双特异性纳米抗体的产量和纯度,采用3种不同的方法进行样品制备和纯化。结果表明,通过机械裂菌并改进缓冲液的盐离子和咪唑浓度以及pH,经His Trap FF亲和色谱柱纯化后,对双特异性纳米抗体分离效果较好,目的蛋白产量超过1 mg/L,纯度可达到97%。同时,anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体能够与细胞表面两个抗原特异性结合,增强IL-2活化的人外周血单个核细胞（PBMC）对胰腺癌细胞株 AsPC-1的杀伤能力,为其后续体内药效学评价奠定了基础。     

亲和层析法纯化抗大肠肿瘤相关抗原的单克隆抗体

目的制备和纯化鼠源性抗人大肠肿瘤单克隆抗体(单抗),分析其相应抗原在大肠肿瘤细胞中的表达。方法常规方法免疫BALB/c小鼠制备腹水,应用G蛋白亲和层析柱对小鼠腹水样品进行分离纯化。采用SDS-PAGE、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA检测纯化后抗体的纯度、活性、效价和特异性。用免疫细胞化学、流式细胞术和免疫组织化学技术S-P法检测其相应抗原在大肠肿瘤细胞株和组织中的表达。结果还原性SDS-PAGE显示所获抗体为单一组分。应用间接ELISA检测抗体效价为1∶106,纯化后的抗体对大肠肿瘤细胞株具有特异结合活性,并在高分化大肠腺癌组织中表现出更高选择性(P<0.01)。结论G蛋白亲和层析法操作简便,所得单抗的纯度高,特异性强,生物学活性好。对临床上早期诊断大肠肿瘤将具有较大的意义。     

谷胱甘肽对乳酸脱氢酶活性影响的动力学研究

目的研究谷胱甘肽(glutathione,GSH)对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性影响的动力学机制并求取抑制常数。方法采用分光光度法追踪酶反应,用Lineweaver-Burk作图法分析动力学机制并用计算法求取抑制常数。结果在pH7．0、25℃、101．3kPa条件下,在由乳酸转变为丙酮酸的酶反应方向,加入不同浓度的GSH对LDH1及LDH5均具有可逆抑制作用,并存在量效关系。随GSH浓度增加,表观Km^NAD 及表观Vmax^NAD 逐渐减小,而表观KTNAD ／Vmax^NAD不变;表观Km^Lac逐渐增大,表观Vmax^Lac不变,而表观Km^Lac／Vmax^Lac增大。结论GSH相对于NAD^ 为LDH1及LDH5的反竞争抑制剂,相对于乳酸为LDH1及LDH5的竞争性抑制剂;GSH结合于E-NAD^ 二元复合物从而降低了酶活性。抑制常数为：KLDHI-NAD^ -CSH=0．397mol／L和KLDH5-NAD^ -CSH=0．033mol／L。     

动脉粥样硬化兔模型血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的动态分析

目的分析实验性动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)大耳白兔血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的变化规律.方法建立兔动脉粥样硬化模型,检测模型各阶段血液中各种脂质、AST、ALT、LDH、CK、Bun、Cre等生化指标.结果成功地建立了动脉粥样硬化兔模型;大白兔在喂食高胆固醇饲料4周或12周时,血液中总胆固醇(CHO)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-ch)浓度升高(P<0.05);AST、ALT的活性和Bun、Cre的含量变化差异无显著性(P>0.05);而LDH和CK的活性随着动脉粥样硬化的进程而逐渐升高,变化差异有显著性(P<0.05﹚,ASa组和ASb组的LDH活性分别比对照组升高2.2倍和3.5倍,CK的活性则分别增加2.4倍和7.5倍.VitE组与ASb组比较,LDH和CK的活性都显著下降(P<0.05).结论提示血清LDH和CK的活性升高与动脉粥样硬化的进程相关;VitE可能对血管内皮细胞和平滑肌细胞具有保护作用.     

乳酸脱氢酶实验检测细胞新陈代谢的实验研究

目的 探索LDH实验检测细胞活力的可行性。方法 原代培养骨髓细胞和软骨细胞，用LDH实验测定上述两组细胞的活力，并与镜下活体观察到细胞的生长状况相比较。与目前比较成熟的测定细胞活力的MTS实验的测得的值相比较。结果 LDH实验对上述两组细胞的活力的测定结果与镜下活体观察到的结果相符合。与MTS实验的测得的结果经统计学处理无显著差异。结论 LDH实验可用于细胞活力的直接测定，而对活细胞的生存、繁殖无影响。     

Purification and characterization of human anti-HBsAg Fab fragment produced by genetic engineering technology

Hepatitis B vims (HBV) infechon is a severe healthboat in China. h was found in some .,.~h..[l'ZJ thatsome special monoclonal anticces (InAb) Play an import IDle in the fight with vial infechon. C~,the InAbs are obtained from murine hybridolna cells andinevitably POssess ~ogenicity against h~. ThePhage-display libel technology makes it POssilile tO averthybridolna technology to directly obtain hUInan anhbodyFab faint and thus foe anhgenicity of the InAbs isavoided. As a result, the h…     

重组人酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化

采用肝素-sepharose亲和层析和SephadexG-100凝胶过滤层析法,从含haFGF基因重组体的大肠杆菌菌体中分离纯化得到人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)。SDS-PAGE,IEF电泳检测均为单一谱带。HPLC层析显示单一蛋白峰,SDS-PAGE测定rhaFGF分子质量为16.67ku,IEF测定等电点pI为4.8,并用Edman降解法测定了N-末端氨基酸序列,Balb/c3T3细胞培养法测定纯化的rhaFGF生物活性ED50为6μg/L,表明其对细胞分裂有明显促进作用。     

缺氧处理小白鼠乳酸脱氢酶同工酶的辅酶化和去辅酶化调控作用

研究生物缺氧应激反应调空模式小白鼠轻度缺的氧心肌乳酸脱氢酶谱变化特点。方法以小白鼠心肌为材料，人工缺氧，乳酸脱氢酶酶活性特异染色。ＣＳ－９１０型双波长薄层层析扫描仪定量测定ＬＤＨ相对百分含量。