晚期氧化蛋白产物模拟表位的初步研究

目的利用噬菌体展示肽库筛选技术获得模拟人晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products,AOPP）表位的序列,探索该表位的分布与表达。方法以抗晚期氧化蛋白产物多克隆抗体为靶,对噬菌体随机12肽库进行免疫亲和筛选,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆特异性;对阳性克隆进行DNA测序并推导其氨基酸序列,利用生物信息学技术检索其分布与相似性。结果经3轮亲和筛选获得18株与靶分子特异结合的阳性噬菌体克隆,阳性率为62.07%。竞争ELISA结果表明,AOPP可有效抑制阳性噬菌体克隆与抗体结合,其中对No.6克隆的IC50达到0.2ug/ml,提示其能模拟AOPP表位。经DNA测序并推导氨基酸序列,得到LXDMLXD保守序列（X为任意氨基酸）;发现该序列不存在于正常人与哺乳动物的蛋白分子,但与某些真菌及寄生虫蛋白分子有同源性。结论通过噬菌体肽库筛选技术获得模拟AOPP表位并具良好抗原性的短肽序列;证实该结构不存在于正常人与哺乳动物蛋白分子,正如AOPP并非正常组织蛋白。     

用噬菌体展示技术筛选喉癌细胞靶向肽的研究

目的筛选人源喉癌Hep-2细胞株特异结合的短肽,作为喉癌靶向治疗的载体。方法体外培养Hep-2细胞株作为靶细胞,人正常喉黏膜上皮细胞为吸附细胞;用噬菌体展示十二肽库进行3轮差减筛选,随机挑取10个噬菌体克隆进行测序;采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法鉴定噬菌体与Hep-2细胞的结合活性;通过免疫荧光鉴定喉癌细胞特异性结合肽（F2）噬菌体阳性克隆与喉癌细胞结合的特异性。结果经过3轮筛选后,噬菌体在靶细胞Hep-2上出现明显富集;ELISA分析鉴定显示5个阳性克隆能与Hep-2细胞特异结合,其中F2噬菌体克隆对喉癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞（P〈0.05）;免疫荧光显色显示,F2能特异性地与喉癌细胞结合。结论利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到F2,其可能成为喉癌靶向治疗的载体。     

人Rh(D)血型抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 从噬菌体随机肽库中筛选人Rh(D)血型抗原模拟表位,并对其免疫学活性进行鉴定.方法 以抗Rh(D)单克隆抗体作为固相筛选分子,对噬菌体随机十二肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选35个克隆,经噬菌体ELISA和交叉反应试验,确定阳性克隆,再对这些克隆进行DNA序列测定和抗体竞争抑制试验,以获取人Rh(D)血型抗原模拟表位.然后采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)对所获噬菌体进行鉴定和抗原性分析.结果 经过3轮淘洗后,噬菌体得到富集,获得11个阳性克隆.DNA序列测定和竞争抑制实验结果表明,这11个克隆噬菌体所展示的外源多肽中有7个克隆氨基酸序列含有相同的色氨酸(W)、脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)结构(-WP-Q-),且均具有40%以上的抑制率;其余4个克隆没有共性,抑制率较低,可能为非特异性结合.Western blot分析表明,被选定的噬菌体能被抗Rh(D)血清特异识别,具有类似于Rh(D)蛋白的抗原性.结论 利用抗Rh(D)单克隆抗体筛选噬菌体随机肽库,成功获得含有(-WP-Q-)结构的Rh(D)抗原模拟表位,为进一步探讨Rh(D)新生儿溶血病的发病机制和疫苗的研究奠定基础.     

三阴性乳腺癌原代细胞的培养及其特异性结合肽的筛选

目的利用噬菌体肽库筛选技术获得与三阴性乳腺癌原代细胞特异性结合的多肽,为探索三阴性乳腺癌的治疗靶点提供试验支持。方法从三阴性乳腺癌新鲜组织分离、培养原代癌细胞并以其为靶细胞,以hs578bst人正常乳腺细胞为吸附细胞,对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选;随机挑取15株富集后的噬菌体单克隆,ELISA及DAB染色鉴定噬菌体克隆的亲和力及特异性,并对阳性噬菌体单克隆测序。结果经过3轮筛选,噬菌体克隆得以明显富集,随机挑取的15株噬菌体单克隆中有11株为阳性,ELISA及DAB鉴定发现,5号噬菌体(phage-5)对靶细胞亲和力及特异性最强,经DNA测序和推导,其多肽序列为PHETLTSFVRRG。结论从噬菌体随机十二肽库中成功筛选出与三阴性乳腺癌原代细胞特异性结合的多肽,该多肽可能作为三阴性乳腺癌靶向治疗药物的载体。     

特异性抗人cyclin D1人源单链抗体的筛选

目的 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定.方法 以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定.结果 经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性.结论 利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体.     

特异性抗cyclin D1人源单链抗体的筛选

目的从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定。方法以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过“吸附-洗脱-扩增”淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定。结果经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体。     

梅毒螺旋体模拟肽的筛选及其生物学功能的初步研究

目的 从噬菌体随机12肽库中筛选梅毒螺旋体模拟肽,并初步研究其生物学功能.方法 自梅毒患者血清纯化多克隆抗体IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,对部分克隆进行测序,用ELISA检测噬菌体克隆的诊断价值.结果 3轮筛选的投入/产出比逐轮升高至5.1×10-4,提示具有良好的富集效果.对从第3轮洗脱物中挑选出的20个克隆进行结合试验,发现19个克隆与梅毒多克隆抗体有较强的结合力.其中6个克隆测序显示为同一克隆(命名为TP1),其外源插入肽为GSMSPYVRWYTP.用TP1检测20例梅毒患者血清,有不同程度的阳性反应.结论 用梅毒多克隆抗体从噬菌体随机12肽库中筛选到具有一定功能的模拟肽.     

乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合肽的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg ）特异性结合的多肽。方法将酵母表达的HBsAg包被在微孔板上,加入噬菌体进行随机肽库筛选,经过4轮筛选后,随机挑取15个克隆进行DNA测序,并通过夹心ELISA方法鉴定其亲和力,采用剂量依赖结合实验和竞争抑制实验检测其与 HBsAg结合的特异性。结果经过4轮筛选,得到一优势克隆No ．3,展示肽段为SSYAPYVWQPIA ,与 HBsAg有较强的亲和力,剂量依赖结合实验和竞争抑制实验证明克隆No ．3与HBsAg的结合是特异性的。结论利用噬菌体展示肽库技术可以获得HBsAg特异性结合肽,此多肽可以作为靶向分子用于乙型肝炎的基因治疗,为乙型肝炎的靶向基因治疗奠定实验基础。     

人前列腺癌细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与人前列腺癌细胞系PC3M细胞特异结合的短肽，作为人前列腺癌靶向治疗的先导化合物。方法以PC3M细胞为靶细胞，正常人前列腺细为吸附细胞对噬菌体7肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫荧光细胞化学胞染色鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选，从随机挑选的10个噬菌体克隆中得到8个能特异性与PC3M细胞结合，而不与正常人前列腺细胞结合的阳性克隆。其氨基酸序列有一定同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合PC3M细胞的噬菌体克隆。本实验获得的短肽具有一定的肿瘤亲合力和特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

系统性红斑狼疮模拟自身抗原肽分子的筛选及其诊断价值的初步研究

目的 从噬菌体随机12肽库中筛选系统性红斑狼疮（SLE）自身抗原模拟肽分子并初步研究其诊断价值。 方法 首先用自健康人血清提取的IgG作为固相配基吸除非特异性噬菌体,再以自SLE患者血清提取的IgG包被,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程对上述处理过的噬菌体液进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆,用ELISA检测其特异性。用混合阳性克隆包被的ELISA法检测SLE、类风湿关节炎（RA）、骨关节炎（OA）患者及健康对照血清与混合阳性克隆的结合力。 结果 经过3轮筛选,回收率从4.4×10^-5增加到1.4×10^-2,得到良好的富集效果。第3轮洗脱物中挑选出的22个克隆中,19个克隆与SLE患者血清IgG具有较强的结合力。用第3轮的混合噬菌体克隆检测SLE、RA、OA患者及健康对照的血清,阳性率分别为80.0%、15.0%、0和0。 结论 成功利用噬菌体12肽库对SLE患者血清进行了模拟肽筛选,得到的模拟肽分子用于ELISA,对SLE具有一定的诊断价值。     

筛选及鉴定IgG型单克隆抗-D噬菌体克隆的实验研究

目的利用随机噬菌体12肽库筛选出血型D抗原的模拟多肽并验证。方法采用Ig G型单克隆抗-D筛选噬菌体随机12肽库,测定每轮筛选后洗脱物与抗-Rh D的结合情况。对经特异性筛选得到的阳性噬菌体克隆进行DNA序列测定,将推导出的12肽氨基酸序列进行同源性比较,通过凝集抑制试验验证阳性噬菌体与Ig G型单克隆抗-D的反应。结果随着筛选轮次增加,噬菌体洗脱物与抗-Rh D的结合力逐渐增强。经过4轮淘洗后,得到8个亲和力较强且具有较高重合率的保守区域的12肽序列。凝集抑制实验表明具有相同氨基酸序列的阳性噬菌体对Ig G型单克隆抗-D与Rh D阳性红细胞的凝集反应具有抑制作用。结论随机噬菌体12肽库筛选得到的血型D抗原模拟多肽,为Rh D结构与功能研究及研制针对Rh D新生儿溶血病的新型诊断抗原、制备特异疫苗以及探索新的治疗方法提供实验基础。     

用噬菌体模拟抗原检测白念珠菌菌丝蛋白抗体的研究

目的 用噬菌体展示文库技术制备白念珠菌菌丝蛋白模拟抗原，建立测定白念珠菌抗体的酶联免疫吸附测定法（ELISA）。方法 用抗白念珠菌菌丝蛋白P47的单克隆抗体从噬菌体随机12肽库中筛选能与之免疫学结合的肽，即模拟抗原表位。将该模拟抗原包被微孔板，用于酶联免疫吸附测定法测定病人血清白念珠菌菌丝蛋白抗体。结果 用噬菌体模拟抗原建立ELISA，其敏感性、特异性及重复性良好，测定了10份确诊白念珠菌侵袭性感染的病人血清，全部阳性，与用纯化的菌丝蛋白抗原P47测定结果一致；服用免疫抑制剂患者血清阳性率33％，健康人群阳性率为2％。结论 用抗白念珠菌菌丝蛋白单克隆抗体从噬菌体展示随机肽库筛到的噬菌体模拟抗原可代替白念珠菌P47抗原进行抗体测定。     

人Rh(D)血型抗原模拟表位筛选及鉴定的临床意义

【目的】探讨人Rh(D)血型抗原模拟表位筛选及鉴定的临床意义。【方法】以抗Rh(D)单克隆抗体作为固相筛选分子,随机选取35个进行克隆,经噬菌体酶联免疫吸附测定法(ELISA)及交叉试验,确定阳性克隆,采用蛋白石免疫印迹法(Western blot)对噬菌体行抗原性分析。【结果】DNA序列测序及竞争抑制实验在11个克隆的噬菌体所展示的外源多肽中有4个克隆无共性,可能是非特异性结合。7个具有克隆氨基酸序列均含有相同的脯氨酸(P)、色氨酸(W)、谷氨酸(Q)结构(-WP-Q-),超过40%的抑制率。Western blot分析表明,被选定的噬菌体能被抗Rh(D)血清特异识别,抗原性与Rh(D)蛋白相类似。【结论】利用抗Rh(D)单克隆抗体筛选噬菌体随机肽库,可获得具有(-WP-Q-)结构的Rh(D)抗原模拟表位。     

噬菌体肽文库的筛选方法

噬菌体显示技术是将化学合成的随机核苷酸序列与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ进行融合 ,从而将各种短肽表达于不同的噬菌体表面。该技术已成功地应用于筛选能与特定的靶分子相结合的特异性短肽 ,如抗体分子、受体分子、核酸分子以及某些碳水化合物等。噬菌体展示随机肽库的库容非常大 ,多肽之所以能够准确无误地、有效地结合于靶蛋白 ,主要原因[1] 为 :两个蛋白间相互作用的重要部分仅仅是 3～ 10个氨基酸残基 ,因此肽足以与蛋白质的主要位点结合 ;肽可以置换目的蛋白中隐蔽的位点 ,而这些位点在其活性或结合位点中起重要作用 ;亲和筛选迫使噬菌体…     

噬菌体环7肽库筛选胰岛素受体亲和肽

目的:筛选胰岛素受体高亲和肽作为肝细胞癌潜在靶向载体。方法:用噬菌体随机环七肽库,与鼠肝胰岛素受体亲和、筛选与扩增。经过三个循环的筛选,测定阳性噬菌体与胰岛素受体的亲和力,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆插入DNA序列,推断出与噬菌体外壳gⅢ蛋白融合的短肽氨基酸残基序列。分析亲和短肽结构特征,固相法选择性人工合成多肽配基TK1,测定多肽TK1与胰岛素受体的亲和力。结果:经过三轮筛选,选择12个阳性克隆测序,11个克隆插入短肽是TK(CysGlnSerLysHisTrpArgHisCys),合成肽TK1(CysGlnSerLysHisTrpArgHisCysTyr)与胰岛素受体有较高亲和力,Kd值为4.31×108L/M。结论:噬菌体肽库筛选小鼠肝胰岛素受体获得了两种多肽配基,多肽TK1与胰岛素受体有较高亲和力,可望作为肝癌靶向多肽,值得进一步研究。     

从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体

目的从Tomlinson（I＋J）噬菌体抗体库中筛选人源化抗HIV-Tat蛋白单链抗体（scFv）并进行鉴定。方法以HIV-Tat蛋白为抗原,通过＂吸附-洗脱-扩增＂过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗Tat蛋白单链抗体,对其进行基因序列测定,并检测其抗原结合活性。结果经过筛选,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VHⅢ型。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Tat蛋白单链抗体。     

抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.     

羊驼噬菌体展示纳米抗体库中Lea模拟抗原表位筛选与鉴定的初步研究

目的:建立一种新型Lewis血型抗原的合成方法,即利用羊驼噬菌体展示纳米抗体库筛选Lewis血型抗原的模拟表位,并将模拟表位序列进行生物合成。方法:用单克隆抗Lewis a (Le^a)抗体亲和淘选羊驼噬菌体展示纳米抗体文库来选择Le^a抗原的模拟表位。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对阳性克隆菌与筛选原Le^a单克隆抗体的亲和力进行检测,选择高亲和力的阳性克隆菌进行测序,并对最终确定的序列进行表达合成。最后通过ELISA法对合成后的Le^a模拟抗原进行灵敏度、特异度以及临床样本的验证。结果:随机挑取96个噬菌体克隆,有24个阳性克隆,并选取亲和力最强的前14个噬菌体克隆进行测序,结果显示有5个不同序列,选取出现频率最高、差异最大、亲和力最高的3条序列进行表达合成。利用ELISA法检测筛选得到的Le^a模拟抗原的灵敏度及特异性,发现微柱凝胶法与ELISA法的最低检出限相差25倍,且Le^a模拟抗原与其他5种单抗(anti-A, anti-B, anti-P1, an...     

人源抗CEA噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人癌胚抗原(CEA)特异性噬菌体抗体库,制备人源抗CEA单克隆抗体(mAb)。方法用常规RT-PCR法,直接从10例结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗CEA噬菌体。结果RT-PCR可有效地扩增出Fd和κ基因并以此构建成容量为5.2×106的噬菌体抗体库。经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集,并成功获得抗CEA噬菌体抗体阳性克隆。结论抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEA mAb的制备,为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础。     

人源性抗百草枯特异性单链抗体的筛选及初步鉴定

目的:从大型人源性噬菌体抗体库中直接筛选出百草枯特异性单链抗体(scFv)。方法:以百草枯人工抗原(PQ-h-OVA)为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程,采用固相化抗原免疫吸附筛选法,从大型人源性噬菌体抗体库中筛选出特异性百草枯单链抗体,通过ELISA法对其特异性结合性能进行初步鉴定。结果:经过5轮筛选,获得两株能与百草枯人工抗原特异性结合的阳性克隆。结论:利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备人源性百草枯抗体,为临床治疗百草枯中毒研究提供了具有更广阔前景的人源小分子抗体。