HIV—1耐药性基因型检测法在临床治疗随访中的应用

目的 探索HIV－1耐药性基因型检测法在高效抗剪转录病毒疗法（HAART）治疗组中监测HIV－1耐药性病毒株的临床应用。方法 从接受HAART的HIV－1感染者血清中抽提病毒RNA，采用套式RT－PCR方法扩增HIV－1和RT基因片段，并对扩增片段进行序列测定和分析。结果 HIV－1耐药性基因型检测法能够从血浆病毒载量在1000拷贝／ml以上的样本中得到扩增产物。在16例接受HAART的HIV－1感染者中，发现1例感染者DP31的PR和RT基因出现了突变，这些突变为L63P、F215F、K219Q和M184V。所有突变均与公开报道的结果一致，并被证明与HIV－1的耐药性有关。另外，DP31在接受HAART前已出现了T215F、K219Q的耐药性突变，究其原因，还有待进一步研究。结果 HIV－1耐药性基因型检测法能有效地监测接受HAART的HIV－1感染者血浆中耐药性病毒株的存在。该方法提供的结果准确、可靠，并且为临床医生评价HAART效果，合理选择和及时优化药物组合方案提供了可靠的依据。     

应用HIV-1耐药性基因型检测广东部分地区HIV耐药株

目的利用艾滋病病毒1型(HIV-1)耐药性基因型检测法,在HIV-1感染者中监测HIV-1耐药性病毒株,掌握广东省HIV-1感染者在利用抗病毒药物治疗前是否存在耐药突变及其流行情况。方法从未接受高效抗逆转录病毒联合疗法(HAART)治疗的HIV-1感染者血浆中提取病毒RNA,采用套式PCR扩增目的基因片断,并对扩增片断进行序列测定和分析。结果HIV-1耐药性基因型检测法能够从HIV-1感染者血浆病毒载量大于1 000拷贝/ml以上、CD4低于400以下的样本中扩增到目的片断。在广东省50例未治疗对象中,低中度耐药相关突变例数为2例,占4%;高度耐药相关突变例数为0;总耐药相关突变例数为2例,占4%。结论HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测HIV-1感染者血浆中的耐药性病毒株的存在,并且方法提供的结果准确、可靠。对广东省未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中耐药突变的检测表明,HIV-1感染者中存在病毒的耐药性突变,也反应了HIV毒株自然变异情况的存在。     

深圳地区男男同性恋人群中HIV-1感染者耐药基因变异研究

目的调查分析深圳地区未接受抗病毒治疗的男男同性恋人群中,人免疫缺陷病毒（HIV）感染者的耐药突变流行情况,以进一步指导抗病毒药物的选择。方法收集2007—2008年,从未接受抗病毒治疗的男男同性恋人群中HIV—1感染者的血浆,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和套式聚合酶链反应（Nested—PCR）方法,扩增蛋白酶（PR）1基因区和反转录酶（RT）基因区,并对扩增片断进行序列测定和分析,并用Mega等软件构建进化树及亚型分析。结果共获得94份HIV-1分离株的完整的PR和RT基因序列,发生耐药突变位点的35份（37．2％）样本序列检出42个耐药性突变位点,其中1份样本产生了核苷类抑制剂（NRTI）、非核苷类抑制剂（NNRTI）耐药性突变,以及蛋白酶抑制剂（PI）主要耐药突变和P1次要耐药突变;5份样本产生了NRTI耐药性突变,20份样本产生了NNRTI耐药性突变,9份样本产生了P1次要耐药突变。非核苷类耐药性突变、核苷类耐药性突变和P1次要耐药突变位点分别以V179E、V118I和A71V为主,分别占65．0％（13／20）、66．7％（4／6）和55．6％（5／9）。结论深圳地区男男同性恋人群中的、未经抗病毒治疗的HIV1感染者中,存在原发性耐药相关基因突变位点变异,耐药基因变异处于较低水平的流行状态。     

福建省HIV-1流行毒株序列测定与亚型分析

使用PCR技术对 19份福建省HIV - 1阳性感染者或病人的外周血淋巴细胞 (PBMCs)进行扩增 ,获得HIV - 1膜蛋白 (env)基因的部分核酸片段 ,并对其V3及邻区～ 30 0个核酸序列进行测定及分析。结果表明 ,19份样品中 11份为E亚型 ,5份为B亚型 ,1份为A亚型 ,1份为C亚型。上述资料表明 ,到目前为止流行于福建省的HIV - 1毒株的特点为以E、B亚型为主 ,多种亚型并存。两者型内以及与国际标准亚型序列的基因离散率均比较大。与其他省份的比较表明我省的毒株的传入与其他省份没有相关     

应用长片段PCR扩增全长HIV-1 DNA的研究

目的 探讨长片段PCR(LD-PCR)扩增特点,并将它用于对全长HIV DNA的研究。方法 应用LTR(U5)/LTR(R),CL-NSC/CL-NEF和gagA1/gagA2等不同引物,~(32)P标记gag、pol、nef和tat等为片段探针,对克隆有HIV-1完整基因片段、部分基因片段的质粒和HIV感染者外周血单核细胞(PBMC)中的HIV-1 DNA进行扩增。结果 LD-PCR对0.4～9kb的一系列标本扩增都很满意,它的扩增效率与DNA分子片段的大小成反比,在混合竞争扩增中,短片段DNA浓度较低时主要扩增长片段标本,增加短片段浓度导致减少长片段DNA的扩增。同时发现在HIV感染者中存在大量大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段。结论 LD-PCR能混合扩增不同大小片段标本,特别是对大片段标本的扩增具有独特的优越性,是普通PCR无法解决的。     

中国部分地区应用高效抗逆转录病毒治疗HIV-1患者的耐药性检测

目的了解我国应用高效抗逆转录病毒治疗的人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者中耐药情况.方法收集我国上海、河南及安徽等地116份应用抗病毒治疗患者的血浆标本,采用逆转录聚合酶链反应扩增pol基因片段并进行序列测定,通过HIV耐药性数据库进行耐药相关性突变分析,并构建进化树.结果共获得44例HIV-1分离株的pol基因序列,有70%（31/44）的标本发现了针对常用的三类抗逆转录病毒药物的主要耐药性突变,其中有34%（15/44）的标本发现了针对核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）的耐药性突变;有68%（30/44）的标本发现了针对非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）的耐药性突变;仅有2%（1/44）的标本发现了对蛋白酶抑制剂（PIs）类药物的主要耐药性突变.亚型分析表明91%（40/44）为B亚型.结论在我国应用抗逆转录病毒治疗的患者中耐药性的产生已经十分严重,尤其是针对NNRTIs的高度耐药性较为突出,迫切需要应用耐药性检测进行指导.     

双杂交技术在HIV-1研究中的应用进展

随着蛋白组学和基因组学研究的进一步深化,双杂交技术也迅猛发展,在研究细胞内蛋白质分子之间或病毒-宿主之间的相互作用等方面发挥重要作用。本文简述双杂交技术的基本原理、主要类型及其在逆转录病毒HIV-1研究中的应用进展。     

HIV-1耐药产生机制及其临床应用

自1996年高效抗逆转录病毒治疗(highly ac-tive antiretroviral therapy,HAART)应用于艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)临床治疗已有10年时间。10年来 AIDS 的发病率和病死率明显下降,患者生存质量得到了显著改善,但病毒耐药性的出现则大大削弱了 HAART 抑制病毒复制的作用,降低了抗病毒治疗效果。目前,已通过美国食品和药品管理局(Food and     

北京市同性恋HIV-1感染者的包膜基因C2-V3区序列测定和亚型分析

目的 了解北京市同性恋HIV-1感染者HIV-1的亚型类型及传播来源和流行时间。方法 应用套式聚合酶链式反应（PCR）对12份1993～2001年北京市HIV-1阳性同性恋者外周血单个核细胞（PBMC）的核酸样品进行扩增,并对其包膜区的C2-V3段的306个核酸序列进行测定和分析。结果12份样品全部是B亚型的HIV-1毒株序列,其亚型内的基因离散率为 10.35± 2.06,与国际 A-E亚型共享序列比较后发现其与 A、C、D、E亚型的共享序列的基因离散率均大于 25％,而与国际 B亚型共享序列的基因离散率仅为11.25±3.60。系统树分析显示,12个毒株与B亚型共享序列聚在一起并远离其它国际亚型,并且12个毒株与SF162紧密相连,而与国际B亚型共享序列和泰国B亚型代表株TH14可以分开。对gp120中最重要的中和抗体决定簇V3环序列进行对比分析发现,12毒株在V3环中变化较大,其中4毒株带有GPGR这一欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征,占33.33％,1个毒株带有GLGR,占8.33％,而其它7个毒株为GWGR,占58.34％。结论HIV-1在北京市同性恋人群中流行的为B亚型,流行来源为欧美,流行时间10年左右,V3环顶端四肽序列特征以GWGR为主。     

深圳市HIV—1B亚型感染毒株env基因序列测定和分析

应用巢式-PCR方法,对深圳检出的2份HIV-1感染者的外周血单核细胞样本进行扩增,获得HIV-1膜蛋白(env)基因核酸片段,并对其C_2-V_3区及邻区350～450个核苷酸序列进行测定和分析.结果表明这2份血样为HIV-1B亚型毒株感染(sz-B),彼此间的基因离散率为10.2%;与A-E国际参考亚型序列比较,sz-B与A及C-E参考亚型共享序列间的基因离散率均大于22%,而与欧美B亚型(Boon)间的基因离散率仅为7.5%;与国内部分地区流行的B亚型代表株比较其基因离散率为11%～12%.提示HIV-1B亚型在深圳的流行时间约为10年,主要经性途径由境外传入,且经性传播途径在人群中流行.     

中国人群中艾滋病抗性的SDF1-3''A 等位基因多态性特征的研究

目的 调查中国汉族、藏族和维吾尔族等8个民族人群中HIV-1抗性的SDF1-3’A等位基因突变频率和多态性的特点。方法 以中国健康人群（2 415例）、性病患者（259例）和 HIV-1感染（217例）人群为研究对象,应用 PCR/RFLP（聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析）和DNA直接测序等方法检测,并进行统计学分析。结果 在彝族、普米族和佤族健康人群中,SDF1-3’A等位基因的突变频率在28.13％～29.86％之间,瑶族和汉族人群分别为26.8％和27.81％;维吾尔族、蒙古族和藏族人群介于19.10％～20.41％之间。性病和HIV-1感染者中,SDF1-3’A的突变频率分别是 27.4％和 24.65％。和美国白人相比（约20％）,我国汉族和云南地区的少数民族人群的SDF1-3’A基因突变频率相对较高。结论 本项研究报道中国人群中SDF1-3’A等位基因的突变和多态性特点,为进一步研究SDF1-3’A等位基因多态性在艾滋病防治中的作用奠定了基础。     

ELISA检测HIV感染者尿液标本中抗HIV-1抗体结果分析

目的利用尿液标本检测抗HIV-1抗体.方法通过ELISA方法检测50例抗HIV-1抗体阳性感染者及100例抗HIV-1抗体阴性对照组尿液中抗HIV-1抗体.结果显示在50例HIV感染者中有49例尿液抗HIV-1抗体阳性,1例阴性;对照组中尿液中均未检测出抗HIV-1抗体,以血液标本为标准,检测尿液抗HIV-1抗体的灵敏性为98.0%,特异性为100%.尿液标本与血液标本检测的一致性达99.3%.结论本实验提示在采集血液标本不便的情况下,可通过尿液抗HIV-1抗体的检测对高危人群的HIV感染情况进行监测和筛查.     

深圳地区艾滋病病毒感染人群的HIV-1抗性基因多态性研究

目的研究HIV-1相关的等位基因CCR5△32、CCR5m303、CCR2b和SDF1在艾滋病病毒感染人群中的分布,为深入分析这些遗传突变在HIV-1感染、艾滋病发病进程中的作用提供理论依据.方法收集深圳地区近年来艾滋病病毒感染者的血液标本共91份,提取基因组DNA.经PCR或PCR-RFLP分析,计算遗传突变频率、纯合子和杂合子的构成比例.采用x2检验或t检验进行群体分布的拟合度和差异的显著性分析.结果在所有被检测的91例HIV-1感染者的个体中,未发现有CCR5△32和CCR5m303的遗传突变,CCR2b-64I和SDF1-3'A的突变频率较高,分别为21.43%和25.82%.与中国普通汉族人的结果相近.结论研究结果提示深圳地区的艾滋病病毒感染者本身对HIV-1病原体可能具有较大的遗传易感性.由于他们具有较高的CCR2b-64I和SDF1-3'A突变频率,后者在艾滋病发病过程中的影响值得进一步研究.     

云南瑞丽HIV-1感染长期存活者的病毒分离及其生物学特性的研究

目的 研究长期不进展者的病毒生物学特征及其与疾病发展的关系。方法 用感染者和正常人外周血单核细胞(PBMC)共培养的方法分离病毒,终点以共培养上清液中的p24抗原作为病毒生长的评价指标。结果 (1)从15例长期不进展者分离到4株病毒,占26.7％。同时取该地区HIV-1感染进展者血样20份,分离到14株病毒,阳性率为70.0％;(2)病毒分离率影响因素的试验结果表明,病毒的分离率与CD_4细胞数有明显关系,CD_4细胞数越高,分离率越低。反之,CD_4细胞数越低,病毒分离率越高。此外,去除CD_8细胞后可以显著提高病毒的分离率;(3)病毒生物学特性观察发现长期不进展者分离株均属生长缓慢、低滴度、非致细胞融合型(NSI型),在T细胞不能生长的病毒;(4)大部分进展者分离株与长期不进展者分离株在生物学特性方面没有显示区别。结论 长期不进展者与大部分进展者的病毒生物学特征没有明显区别,因此,推测病毒学因素可能不是决定病程进展的最主要因素。影响疾病进展的其它因素,如免疫因素等尚需进一步研究。     

中国汉族人群中艾滋病相关的CCR2-64I和CCR5-C927T等位基因的多态性分析

目的 调查中国汉族人群中艾滋病相关的CCR2-64I和CCR5-C927T等位基因突变频率和多态性特点。方法 用试剂盒提取中国889例汉族人外周血单个核细胞的基因组DNA,随之进行聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)技术和DNA直接测序法分析,并对有关的数据进行统计学分析。结果 在检测的889例个体中,野生型CCR2-64I等位基因纯合子(基因型64V/64V)有570例,杂合子(64V/64I)298例,突变纯合子(64I/64I)21例,所占百分比分别是64.1％、33.5％和2.36％,CCR2-64I等位基因突变频率为0.1913。在889份基因样品中,有93例经过CCR5-C927T基因突变检测,结果显示野生型CCR5-C927T纯合子(基因型C/C)为63例,占67.7％;杂合子(C/T)为26例,占28.0％;突变纯合子基因型(T/T)为4例,占4.3％;CCR5-C927T等位基因频率为0.183。统计分析表明在我国汉族人群中,上述两种等位基因多态性呈Hardy-Weinberg平衡分布。结论 本研究首次阐明了土生土长的中国汉族人群中CCR2-64I和CCR5-C927T等位基因突变频率和多态性特点,这一结果将有助于综合评估中国人群对HIV-1感染的遗传易感性,同时为深入研究HIV-1抗性基因在艾滋病发病机制中的作用奠定了基础。     

Utility of repeat genotypic resistance testing and clinical response in patients with three class resistance and virologic treatment failure

We sought to determine the utility of repeat genotypic resistance testing (GRT) and the clinical response in HIV-1-infected patients with known resistance to three of the major classes of antiretroviral drugs. The HIV-1 genetic sequences for 20 patients who had high-level 3 class resistance demonstrated on a prior GRT (3C-GRT 1) measured during the period from November 1, 2000 through July 1, 2004 were retrospectively evaluated. At the time of 3C-GRT 1, the median CD4 count and HIV-1 RNA viral load were 168 cells/mm(3) and 4.5 log copies per milliliter, respectively. The median time to the second GRT (3C-GRT 2) was 17 months. At that time, the median CD4 count and VL were 140 cells/mm(3) and 4.9 log copies per milliliter (p = 0.8 and p = 0.12, respectively). On 3C-GRT 2, all patients retained essentially identical mutations, with the exception of the loss of the M184V mutation in 6 patients. After 3C-GRT 2, all patients continued on protease inhibitor-containing highly active antiretroviral therapy (HAART) regimens. At 24 weeks after 3C-GRT 2, there was no significant change in CD4 count or HIV-1 RNA viral load (p = 0.68 and p = 0.30, respectively). Repeat GRT in patients with documented high-level 3 class resistance does not provide new or clinically useful information. Under continued antiretroviral selective pressure, the viral genetic sequences in this patient population remained stable. In addition, continuing HAART regimens containing protease inhibitors appeared to forestall further immunological and virologic deterioration in patients with multiple resistance mutations. Providers should focus on obtaining access to combinations of novel agents for patients with 3 class resistance rather than repeated GRT.