不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌黏附和侵入口腔上皮细胞能力的比较

目的 通过比较临床分离的不同fimA型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌株黏附和侵入KB细胞的能力,探讨不同fimA基因型Pg菌株之间致病力差异的原因.方法 应用培养法和抗生素保护法测定不同fimA型Pg菌株黏附和侵入KB细胞的能力,扫描电镜观察不同fimA型Pg对KB细胞的黏附情况.结果 所有菌株均可黏附和侵入KB细胞,黏附率为0.523%～37.125%,侵入率为0.017%～3.750%;各fimA型Pg菌株之间黏附和侵入KB细胞的能力差异无统计学意义(P>0.05);各株Pg之间、4株Ⅱ型菌株之间、5株Ⅳ型菌株之间,黏附和侵入KB细胞的能力差异有统计学意义(P<0.01).结论 Pg的fimA型与其对KB细胞的黏附和侵入能力无相关性,提示可能存在其他影响不同fimA型Pg致病力差异的因子.     

龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌rgpB基因多态性研究

目的 探讨不同rgpB基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎发生发展中所起的作用。方法 选择不同牙周状态下的龈下菌斑样本104个，设计引物对牙龈卟啉单胞菌rgpB催化域基因进行扩增，用限制性片段长度多态性分析的方法将牙龈卟啉单胞菌分为4个基因型。结果 慢性牙周炎患者病变重部位rgpB-cdⅣ型检出率最高为52．78％，与Ⅰ、Ⅲ型比较差异有统计学意义（P〈0．05、P〈0．01），病变轻部位rgpB-cdⅡ型检出率为75．86％，显著高于其他型（P〈0．01）。结论rgpB-cdⅣ型可能与慢性牙周炎的关系最密切，在致病过程中起主要作用，而rgpB-cdⅡ型可能与慢性牙周炎无关，为健康人群或牙周健康部位的定居菌。     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2基因缺陷型突变株的构建

目的 构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-adhesin 2,HA-2)基因缺陷型突变株,为研究HA-2基因功能奠定基础.方法 PCR扩增PgHA-2基因两翼片段HA_u、HA_1,将抗性基因ermF-ermAM连接到两者之间构建打靶载体HA-ermF-ermAM.将HA-ermF-ermAM电转化PgATCC33277,基因同源重组整合进入PgATCC33277染色体,用选择性培养基筛选获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.进行PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与其野生株凝血功能试验,比较二者的凝血功能差异.结果 PCR、酶切和测序鉴定结果表明,打靶载体HA-ermF-ermAM成功构建.经PCR鉴定,打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入PgATCC33277染色体,成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.凝血实验结果表明,PsATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与野生株相比凝血能力明显减弱.结论 成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株,为进一步研究HA-2的生物学性质奠定了基础.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶表达的影响

目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)表达水平的影响,探讨fimA基因型与Pg致病力之间的关系.方法 Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、WCSP115(Ⅱ型)、WCSP1.5(Ⅲ型)、W83(Ⅳ型)分别与牙龈成纤维细胞在标准条件下共同孵育(对照组为达尔伯克氏改良伊格尔培养基),于孵育后1、3、6和12 h收集细胞和培养上清液,应用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA法分别检测牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA及蛋白的动态表达.结果 与对照组相比,Pg刺激下牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA和蛋白水平表达量均明显上调(P<0.01);其中Ⅱ型fimA型Pg的刺激作用强于其他各型,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(28.88±3.12)～(231.01±24.99)、(1.35±0.17)～(3.08±1.20);MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(20.42±2.21)～(188.34±37.37)、(2.57±0.76)～(18.08±1.15),与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ型Pg的刺激作用较弱,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(5.11±0.55)～(72.84±8.84)]μg/L、[(0.68±0.13)～(1.46±0.94)]μg/L;MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(4.55±0.55)～(25.75±3.12)]μg/L、[(2.28±0.93)～(11.22±2.46)]μg/L,与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 Pg可以诱导牙龈成纤维细胞过表达MMP,fimA基因型与Pg的毒力作用相关,fimA型可能为Pg致病力差异的基因基础.     

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K-caspase样亚基的表达与青春期龈炎的临床相关性

目的检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，PS）临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K（gingipain K，Kgp）-caspase样亚基的表达强度及酶活性，揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法检测并记录36例14～17岁的青春期龈炎患者的牙龈指数、龈沟出血指数及探诊深度，取龈下菌斑进行Pg的分离培养，16SrRNA PCR法鉴定。将获得的10个Pg临床分离株复苏，在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白，测定其酶活性，并用Kgp-caspaae样亚基的单克隆抗体进行Western blot检测。Kgp的表达强度及酶活性与各牙周指数之间的相关关系用等级相关系数。结果青春期龈炎的Pg临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中，Kgp-caspase样亚基的表达强度及酶活性与各牙周指数的大小呈正相关关系，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论青春期龈炎龈下菌斑中Pg的Kgp十分复杂，存在表现为低相对分子质量形式的caapase样活性分子，这些细胞内功能蛋白分子将影响Pg和宿主间的相互作用；Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。     

牙周炎患者基础治疗后牙龈卟啉单胞菌的定植研究

目的 通过对牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalu,Pg)的检测,探讨慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)和侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)患者牙周基础治疗后Pg的定植规律.方法 选取90例CP患者和90例AgP患者,在牙周基础治疗前、治疗后6周、12周共采集龈下菌斑样本1620个,运用AmpliFluor终末点定量聚合酶链反应方法 检测Pg含量.结果 治疗后6周CP和AgP组Pg活动位点分别为61(22.6%)和66(24.4%)个,两者差异无统计学意义(P>0.05);治疗后6周Pg活动位点在治疗前检测的牙周临床指数高于Pg静止位点.治疗后12周两组Pg活动位点分别为96(35.6%)和18(6.7%)个,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后12周Pg活动位点在治疗后6周时检测的牙周临床指数高于Pg静止位点.结论 在牙周基础治疗后6周时,CP和AgP患者Pg定植均已开始,仉是两组定植规律存在一定差异.在牙周基础治疗后,治疗前牙周组织炎性反应严重的龈下位点Pg易于定植.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌黏附和侵入口腔上皮细胞能力的比较

目的 通过比较临床分离的不同fimA型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌株黏附和侵入KB细胞的能力,探讨不同fimA基因型Pg菌株之间致病力差异的原因.方法 应用培养法和抗生素保护法测定不同fimA型Pg菌株黏附和侵入KB细胞的能力,扫描电镜观察不同fimA型Pg对KB细胞的黏附情况.结果 所有菌株均可黏附和侵入KB细胞,黏附率为0.523%～37.125%,侵入率为0.017%～3.750%;各fimA型Pg菌株之间黏附和侵入KB细胞的能力差异无统计学意义(P>0.05);各株Pg之间、4株Ⅱ型菌株之间、5株Ⅳ型菌株之间,黏附和侵入KB细胞的能力差异有统计学意义(P<0.01).结论 Pg的fimA型与其对KB细胞的黏附和侵入能力无相关性,提示可能存在其他影响不同fimA型Pg致病力差异的因子.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌黏附和侵入口腔上皮细胞能力的比较

目的 通过比较临床分离的不同fimA型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌株黏附和侵入KB细胞的能力,探讨不同fimA基因型Pg菌株之间致病力差异的原因.方法 应用培养法和抗生素保护法测定不同fimA型Pg菌株黏附和侵入KB细胞的能力,扫描电镜观察不同fimA型Pg对KB细胞的黏附情况.结果 所有菌株均可黏附和侵入KB细胞,黏附率为0.523%～37.125%,侵入率为0.017%～3.750%;各fimA型Pg菌株之间黏附和侵入KB细胞的能力差异无统计学意义(P>0.05);各株Pg之间、4株Ⅱ型菌株之间、5株Ⅳ型菌株之间,黏附和侵入KB细胞的能力差异有统计学意义(P<0.01).结论 Pg的fimA型与其对KB细胞的黏附和侵入能力无相关性,提示可能存在其他影响不同fimA型Pg致病力差异的因子.     

纤维蛋白原对牙龈卟啉单胞菌黏附口腔上皮细胞的影响

目的探讨血浆蛋白成分纤维蛋白原（Fg）在牙周病发病机制中的作用。方法体外培养口腔上皮细胞系KB细胞至单层融合，分别与不同浓度Fg溶液共同孵育，并加入以^3H-胸腺嘧啶核苷标记的牙龈卟啉单胞菌（Pg）行细菌感染攻击细胞实验。采用同位素闪烁光谱测定法检测黏附和内化于KB细胞的Pg数量。结果加入Fg的各实验组黏附和内化细菌量及细菌黏附和内化率均显著高于未加入Fg的对照组；不同Fg浓度的各组间黏附和内化细菌量及黏附和内化率差异亦有统计学意义，随着Fg浓度的升高，黏附和内化的细菌量显著增加。结论纤维蛋白原可促进Pg黏附于口腔上皮细胞，在牙周病的发生、发展中可能具有一定的病理学作用。     

长期低剂量牙龈卟啉单胞菌感染对脂蛋白基因敲除小鼠动脉粥样硬化形成的影响

目的 评价牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)口腔内低剂量、长期、多次接种是否可影响载脂蛋白基因敲除小鼠(apolipoprotein E-knocked out,ApoE-/-)的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成进程和病变程度.方法 20只C57BL/6背景小鼠,将其中13只种属为C57BL/6背景的ApoE-/-小鼠按随机数字表随机分成两组,实验组7只使用1013个/L的牙周致病菌Pg进行口腔内涂菌接种,持续15周共75次,对照组6只同法口腔内涂擦无菌肉汤培养基,比较两组小鼠体质量、血总胆固醇、三酰甘油及主动脉AS病损面积及病理组织变化的情况.另7只野生型C57BL/6小鼠取其主动脉组织作为正常对照.结果 实验组ApoE-/-小鼠主动脉AS病损平均面积为(98 363.68±12 043.00)μm2,显著大于未接种的小鼠对照组[平均病损面积(62 985.06±7419.64)μm2],P=0.035;两组体质量、血总胆固醇和三酰甘油差异均无统计学意义;与野生型C57BL/6小鼠正常主动脉相比,ApoE-/-小鼠主动脉内壁均有凸向管腔内的AS病损,且动脉壁变平,实验组较对照组AS斑块更明显,动脉管腔更狭窄.结论 Pg口腔内低剂量长期多次接种可以加速ApoE-/-小鼠AS的进展.

Abstract：

Objective To assess the effect of longterm and lower oral inoculation with Porphyromonas gingivalis (Pg) on the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-knocked out (ApoE -/-) mice. Methods Six-week-old male ApoE -/- mice were inoculated orally with 0. 1 ml live Pg(1013/L) or bouillon culture-medium quintic per week for 15 consecutive weeks, altogether 75 times of inoculations. The lesion area of atherosclerosis in the aortic tree was measured by en face quantification by red oil O staining method. The atherosclerotic lesion was examined by histopathology. The levels of total cholesterol and triglycerides were compared. Results At 22 weeks after inoculation, the mean atherosclerotic lesion area in inoculated mice was (98 363.68 ± 12 043.00) μm2 ,which was significantly greater than that in noninoculated mice, which was (62 985.06 ± 7419. 64) μm2 (P = 0. 035).Conclusions Longterm lower oral inoculation of Pg can accelerate the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-knocked out mice.     

牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化发病的关系

慢性牙周炎是心血管疾病特别是冠心病的危险因素之一,然而其相关的生物学基础目前尚不清楚.笔者下面就与慢性牙周炎关系最为密切的牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化的相关性和牙龈卟啉单胞菌致动脉粥样硬化的可能机制以及Toll样受体在牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化相关性中的作用作一综述.     

牙龈卟啉单胞菌脂蛋白基因在慢性牙周炎及牙周健康者中的检测

目的 应用基因芯片技术检测3种脂蛋白基因PG0717、PG0183、PG2135在慢性牙周炎患者和牙周健康者牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)中的分布,探讨这些基因与牙周临床指数之间的关系,为研究脂蛋白在Pg致病过程中的作用提供依据.方法 选取41例慢性牙周炎患者(牙周炎组)及76例牙周健康者(健康对照组),记录探诊深度、附着丧失、探诊出血及牙齿松动度,取龈下菌斑进行细菌分离培养,以临床采集的样本提取的DNA为探针,以抑制消减杂交技术获得的PgW83特异基因片段PG0717、PG0183、PG2135为目标序列,采用Cy5荧光标记目标序列.应用基因芯片技术检测PG0717、PG0183、PG2135基因在牙周炎组病变部位、非病变部位和健康对照组Pg中的分布.结果在牙周炎组病变部位PG0717、PG0183、PG2135基因的检出率分别为90%(18/20)、70%(14/20)、70%(14/20),非病变部位的检出率分别为60%(12/20)、45%(9/20)、40%(8/20),而在健康对照组PG0717、PG0183、PG2135的检出率分别为55%(11/20)、25%(5/20)、30%(6/20).3种脂蛋白基因在牙周炎组病变部位和健康对照组中的检出率差异均有统计学意义(P＜0.05),并且与牙周探诊深度、临床附着丧失、探诊出血及牙齿松动度相关.结论 带有PG0717、PG0183、PG2135基因的Pg菌株致病力强.     

牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化

大量流行病学证据已经证实牙周病和动脉粥样硬化存在一定的相关性,目前的研究主要偏向于牙周病在动脉粥样硬化病因中的作用机制,牙周病的病原体如牙龈卟啉单胞菌是否为动脉粥样硬化的病原体尚不清楚.本文对牙龈卟啉单胞菌在动脉粥样硬化发生、发展过程中所起的作用作一综述.     

Correlation between cell-adherent activity and surface structure in Porphyromonas gingivalis

The cell-adherent ability of 6 strains of Porphyromonas gingivalis (381, ATCC 33277, SU63, KD1, W50 and W83) was compared by using radiolabeled bacterial cells and human gingival fibroblasts (Gin 1), human periodontal ligament fibroblasts (HPLF) and human epithelial cells (Ca9-22) that had been grown on collagen beads. The cell-adherent activity of these organisms varied among strains; P. gingivalis strains 381, ATCC 33277 and SU63 bound to the target cells at a range of 14% to 72%, but the other 3 strains (KD1, W50 and W83) were scarcely bound (0.6% to 3.5%). On the other hand, whole bacterial cells and culture supernatants of all strains showed distinct hemagglutinating activity. The 3 strains showing high cell-adherent activity were hydrophobic and the other strains showing less activity were relatively hydrophilic. Furthermore, a number of peritrichous fimbriae were found on the surface of P. gingivalis strains 381, ATCC 33277 and SU63, which showed high adherent activity, whereas, fimbriae on the other 3 strains showing low adherent ability were barely apparent. Therefore, it was assumed that the cell-adherent activity of P. gingivalis was related to the hydrophobicity of the cell surface, which was related to the number of fimbriae.     

牙龈卟啉单胞菌PG1055基因在临床菌株中的表达

目的应用基因芯片技术检测PG1055基因在不同人群的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)中分布,探讨这些基因与牙周临床指数之间的关系。方法取龈下菌斑进行细菌分离培养,以临床采集样本提取的DNA为探针,以抑制消减杂交技术获得P.gingivalisW83的特异基因片段PG1055为目标序列,采用Cy5荧光标记目标序列。应用基因芯片技术检测PG1055基因在牙周病患者及健康人群的牙龈卟啉单胞菌中的分布。结果PG1055基因在牙周病患者及健康人群中的检出率有统计学差异,并且与牙周临床指数相关。结论PG1055基因与P.gingivalis的致病性有关。     

牙龈卟啉单胞菌prtH基因克隆及其多态性的研究

目的：建立牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g)prtH全基因序列的克隆株，分析5株不同P.g菌株中prtH基因多态性。方法：利用PCR技术获得prtH全基因序列，克隆至载体pGEM-T;设计3对引物，用PCR的方法扩增prtH基因的不同区域；以生物素标记prtH基因序列为特异性探针，用斑点杂交和Southern印迹杂交进一步分析prtH基因的多态性。结果：酶切分析和DNA测序证实重组质粒pGEM-T-prtH的插入片段为prtH基因序列；核酸分子杂交显示菌株W 381和ATCC 33277杂交类型一致，菌株ATCC 49417和菌株14－3－2呈现各自不同的杂交条带，而菌株47A－1中未检测到prtH基因。结论：不同P.g菌株中prtH基因序列存在差别，这种基因多态性提示不同P.g菌株毒力大小可能存在差异。所建立的PCR扩增技术可以敏感地检测prtH基因的存在。     

Identification of the genes associated with a virulent strain of Porphyromonas gingivalis using the subtractive hybridization technique

Background/aims:  Porphyromonas gingivalis , a major etiological organism implicated in periodontal disease, can be classified into virulent and avirulent strains. Our aim was to identify a gene for the virulence of P .  gingivalis .
Methods:  The subtractive hybridization technique was employed to identify the genes specific to P .  gingivalis W83, a virulent strain. In this study, P. gingivalis W83 was used as the tester strain, and P .  gingivalis ATCC 33277 was the driver strain. The prevalence of W83-specific genes was determined by Southern blot analysis of several P. gingivalis strains.
Results:  We obtained 575 colonies using the subtractive hybridization technique. From among these, 26 DNA fragments were subjected to a homology search using the BLAST program. Compared with strain ATCC 33277, strain W83 contained 12 unique clones. The specificities of the isolated DNA fragments were analyzed among four P. gingivalis strains by Southern blot analysis. Five genes showed specificity for strain W83 compared with strain ATCC 33277. All five genes were also identified in strain W50.
Conclusions:  The subtractive hybridization technique was effective in screening the two strains for specific DNA sequences, some of which might be responsible for determining virulence. The results suggested that several genes specific to strain W83 were associated with its virulence. Further analysis of these DNA fragments will provide important information on the pathogenesis of virulent P .  gingivalis strains.     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对泡沫细胞凋亡基因的影响

目的 了解牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipopmtein,oxLDL)形成泡沫细胞过程中和形成后对凋亡基因的影响,以期了解Pg影响动脉粥样硬化的可能机制.方法 以oxLDL、oxLDL+Pg-LPS刺激人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1源性巨噬细胞,以及oxLDL诱导巨噬细胞形成的泡沫细胞.采用吖啶橙-溴化乙锭双染色观察细胞凋亡,聚合酶链反应(PCR)芯片检测11种动脉粥样硬化相关凋亡基因的变化,实时PCR检测p53、c-Myc和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3基因的变化.结果 Pg-LPS提高了巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞过程中和形成后的细胞凋亡率,分别为(5.47±0.93)%、(7.50 4-0.54)%;PCR芯片检测显示泡沫细胞形成过程中Pg-LPS上调了B细胞淋巴瘤-白血病-2相关蛋白Al的转录(>2倍),泡沫细胞形成后上调了B细胞淋巴瘤-白血病-2和B细胞淋巴瘤-白血病-2相关蛋白A1的转录(>2倍);在泡沫细胞形成过程中提高了p53和caspase-3的转录水平[分别为(4.50×10-3±4.02×10-4)和(5.30×10-2±4.58×10-3)],抑制了c-Myc的转录水平(1.53×10-2±5.77×10-4);在泡沫细胞形成后降低了p53转录水平(4.23×10-3±5.85×10-4),促进了caspase-3的转录水平(6.00×10-2±6.08×10-3),P<0.05.结论 Pg-LPS影响了泡沫细胞形成过程中和形成后细胞中多种凋亡基因的转录,促进了凋亡的发生.     

Stress response of Porphyromonas gingivalis

The heat shock response of Porphyromonas gingivalis was examined by 1 - and 2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis after metabolic labeling with [¹⁴C]-amino acids. When P. gingivalis cells were shifted from 37° C to 42° C, elevated synthesis of 4 proteins with the apparent molecular weight of 92, 80, 74, and 62 kDa was observed, and synthesis of a 50-kDa protein decreased during heat shock. The 74- and 62-kDa proteins were identified as homologs of Escherichia coli DnaK and GroEL respectively by Western immunoblotting. On 2-dimen-sional Western blots, 2 forms of DnaK and 4 forms of GroEL were identified due to their slightly different isolelectric points. dna K and gro EL gene homologs were identified in several P. gingivalis strains and some other black-pigmented oral species. DnaK and GroEL homolog proteins were induced when P. gingivalis cells were challenged by ethanol. These proteins were not induced by oxidative stress or change in pH.