单个B细胞制备CRP单克隆抗体及其ELISA检测体系的初步建立

目的:用单个B细胞抗体制备技术结合Exip293真核表达系统制备hs-CRP单克隆抗体。方法:用重组CRP蛋白免疫小鼠,荧光标记探针和流式分选技术分离出表达CRP单克隆抗体的单个B细胞,通过PCR方法扩增出编码CRP单克隆抗体蛋白的轻重链核酸序列并构建重组质粒,质粒转染到Expi 293细胞中制备出单克隆抗体蛋白。结果:用间接ELISA法筛选出两个具有良好特异性的单克隆抗体20#,22#,将这两个抗体配对并建立ELISA双抗体夹心检测方法,CRP浓度在15～250 ng/ml范围内有较好的检测线性(y=0. 003x-0. 035 8,R2=0. 997 4),精密度分析的批内变异系数CV为6. 7%～9. 37%,批间变异系数为8. 52%～9. 10%,平均回收率为98%,与临床血清检测值具有良好的相关性,达到CRP检测要求。结论:本研究所用的单个B细胞分离分选方法结合Expi 293真核表达系统在制备单克隆抗体方面具有省时、高效、特异性好、灵敏度高的特点,具有很好的应用价值。     

单克隆抗体在农药残留检测中的应用

自1975年Kohler和Milstem创建了杂交瘤技术制备单克隆抗体以来,单克隆抗体已广泛应用于医学、农业及其他生物领域中。本文阐述了农药单克隆抗体的制备流程、已发展的农药单克隆抗体种类及农药残留常用的免疫分析方法,并就农药单克隆抗体制备值得注意的问题提出了建议。     

组蛋白与某些单克隆抗体发生非特异性免疫反应的研究—自身免疫性疾病发病机理探讨

本文描述了应用免疫双扩散技术检查组蛋白与某些单克隆抗体发生非特异性免疫反应。对抗人C—反应性蛋白(CRP)4株单克隆抗体进行了鉴定,它们识别了CRP上不同的抗原决定簇。组蛋白能够与CRP,纤维连接蛋白(FN),结核杆菌的单抗腹水起免疫沉淀反应,但不与其多克隆抗体及骨髓瘤病人血清起反应。组蛋白能与某些单抗起反应,初步解释了在自身免疫性疾病中抗组蛋白抗体产生的可能机制,说明组蛋白在机体免疫中具有一定的免疫调节作用。     

抗大肠杆菌分子伴侣GroEL单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备抗大肠杆菌分子伴侣GroEL的单克隆抗体.方法 超声裂解制备大肠杆菌DHSa菌体蛋白,免疫小鼠后用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体.采用免疫沉淀方法分离大肠杆菌菌体蛋白中的目的条带,通过质谱分析,鉴定目的蛋白为GroEL.结果 菌体蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体33株,其中单克隆抗体1A5免疫沉淀得到的蛋白,经质谱鉴定为大肠杆菌分子伴侣GroEL.结论 成功制备抗大肠杆菌分子伴侣GroEL分子的单克隆抗体,为进一步研究分子伴侣GroEL的结构和功能提供了新的手段.     

抗血管紧张素Ⅱ单克隆抗体制备及初步鉴定

目的 运用杂交瘤技术制备血管紧张素Ⅱ单克隆抗体,并对其进行初步鉴定.方法 制备血管紧张素Ⅱ免疫原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过筛选克隆后获得细胞株并制备血管紧张素Ⅱ单克隆抗体,对抗体的亚型、效价、亲和常数、交叉反应率进行测定并评估其用于化学发光免疫分析的性能.结果 共制备出6株单克隆抗体,其中9A2、3B3株单抗具有良好的亲和力、特异性、灵敏度和稳定性,9A2株单抗用于化学发光免疫分析测定样本结果与正常人水平一致.结论 本研究成功制备出亲和力高、特异性和稳定性好的血管紧张素Ⅱ单克隆抗体,可应用于AⅡ化学发光免疫分析中,具有良好的临床检测价值.     

人端粒酶hTERT抗体制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用

目的：人端粒酶蛋白亚基（hTERT）单克隆抗体制备及肿瘤检测应用。方法：利用多肽固相合成法（Fmoc法）合成hTERT抗原多肽,免疫BALB／c小鼠,以杂交瘤法制备单克隆抗体。应用ELISA,Western blot和免疫组织化学ABC法进行鉴定和肿瘤检测。结果：经合成得到hTERT抗原多肽hTERT9,免疫小鼠及细胞融合后得到抗hTERT9杂交瘤细胞;经３次有限稀释法及ELISA筛选获得抗hTERT9单克隆抗体的杂交瘤细胞H4、G8和A11;H4、G8为IgM类,而A11为IgG1。半抗原竞争性抑制实验证明为hTERT9特异性单克隆抗体;相对亲和力实验发现G8株亲和力较H4株和A11株强。用H4及G8株单克隆抗体检测HeLa、293细胞,免疫印迹有特异相对分子质量≈123000hTERT条带,免疫组织化学显示为细胞核着色,而正常细胞2BS无阳性反应。免疫组织化学方法检测人癌组织、癌前病变、良性病变hTERT表达发现：人肿瘤组织细胞阳性率为80．31％（102／127）,且大多为中度阳性和强阳性;癌前病变中,hTERT有17．5％（7／40）弱阳性;良性肿瘤均为阴性。统计学分析表明：hTERT在癌组织的表达显著高于癌前及良性病变（P＜0．01）。结论：通过固相合成hTERT抗原多肽和杂交瘤技术成功制备抗人端粒酶蛋白亚基hTERT单克隆抗体,并能运用于免疫印迹、免疫组织化学对癌细胞及组织的hTERT表达检测。     

抗PSMA 膜外域单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗PSMA膜外域单克隆抗体。方法:应用生物信息技术预测PSMA膜外域多肽抗原片段,原核表达,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗PSMA膜外域单克隆抗体,亲和层析纯化和Western blot及ELISA鉴定,并用于前列腺癌动物模型放射免疫显像。结果:经软件分析,获得含310aa序列特异性强的膜外域抗原片段,免疫、融合后,经过ELISA筛选获得到3株阳性杂交瘤细胞株(5E6、4A5和4D7),亚型鉴定结果为5E6、4A5为Ig G2a,4D7为Ig G1,腹水型抗体效价均在1∶256 000以上;Western blot结果表明,所制备的单克隆抗体均可与PSMA膜外域抗原特异性结合,竞争抑制ELISA试验显示制备的单抗与重组抗原及标准抗原PSMA能竞争结合。动物模型放射免疫显像结果进一步证实,制备的单克隆抗体在动物体内能与PSMA膜外域抗原特异性结合,并使肿瘤显像。结论:制备的抗PSMA膜外域单克隆抗体能特异性识别PSMA抗原,为前列腺癌的免疫诊断及免疫治疗奠定了基础。     

抗新型锌指蛋白ZBTB20单克隆抗体的制备和鉴定

目的： 制备新型锌指蛋白ZBTB20的单克隆抗体,建立敏感和特异的ZBTB20免疫学检测方法,为其生物学功能研究提供技术支持。方法：将经ZBTB20多肽免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,用ZBTB20的GST融合蛋白为包被抗原进行ELISA筛选,经4次亚克隆后建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化抗体,鉴定其在免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化中的应用效果。结果：成功制备了8株抗ZBTB20单克隆抗体,在不同的免疫学检测中均得到成功应用,尤其是单克隆抗体9A10具有敏感性高、特异性好和通用性强等优点。结论：首次成功制备了ZBTB20单克隆抗体,可应用于免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化等免疫学检测,对ZBTB20的功能研究具有重要意义。     

一次细胞融合制备分泌抗狂犬病毒单抗杂交瘤及分泌抗独特型单抗杂交瘤的实验研究

根据独特型与抗独特型的免疫网络与免疫调节学说，利用狂犬病毒作为免疫原，设计了不同的动物免疫方案，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞经一次融合，同时获得了分泌抗狂犬病毒单克隆抗体杂交瘤及分泌狂犬病毒抗独特型单克隆抗体杂交瘤，为抗独特型抗体的制备开辟了一条简捷经济的途径。     

葡萄胎病理相关基因F10编码蛋白单克隆抗体的制备与应用

目的 构建原核质粒表达葡萄胎相关新基因F10重组蛋白,分离纯化制备其单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法用逆转录聚合酶链反应法从成人组织中扩增F10编码序列,将其克隆到p ET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达F10基因重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌F10单克隆抗体的效价和类型,免疫组织化学染色检测F10蛋白在葡萄胎及胎盘组织中的表达,鉴定制备F10单克隆抗体的特异性。结果 成功构建了p ET28a/F10原核表达质粒并获得高纯度的重组F10蛋白。筛选出3株能稳定分泌抗F10蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶7.2×105,免疫球蛋白类型均为Ig G1类。免疫组织化学染色显示该抗体能特异结合葡萄胎及胎盘绒毛组织中的F10蛋白,且葡萄胎组织中F10蛋白的表达显著高于正常胎盘组织。结论 表达及纯化的重组F10蛋白纯度高,免疫原性强。以此为抗原制备的抗F10蛋白的单克隆抗体效价高、特异性强,可用于F10功能的进一步研究。     

分泌抗人乙酰胆碱受体抗体骨髓杂交瘤细胞的制备及鉴定

目的:从大鼠骨髓制备抗人乙酰胆碱受体(AchR)的单克隆抗体。方法:在E.coli中表达人AchRα1亚基,Ni-NTA层析纯化包涵体,并经透析复性。用所纯化的蛋白免疫Lewis大鼠诱导重症肌无力,免疫后大鼠的脾脏和骨髓分别与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体。结果:成功在E.coli中表达了人AchRα1亚基的膜外区,用复性蛋白免疫大鼠诱导出重症肌无力症状。用免疫大鼠的脾脏和骨髓分别制备了单克隆抗体。结论:可以用制备杂交瘤的方法将骨髓B细胞永生化,为进一步研究重症肌无力发病机理和检测奠定了基础。     

基因疫苗脾内免疫制备抗人c-kit单克隆抗体及其初步鉴定

目的：用基因脾内免疫方法制备抗人c-kil单克隆抗体，并通过对抗体生物学特性的初步研究，确定该方法制备抗体的可行性。方法：利用分子克隆方法构建重组质粒pcDNA3．1／c-kit胞外区，脾内免疫BALB／c小鼠一次，通过杂交瘤技术制备抗人c-kit单克隆抗体。采用流式细胞术、Western blot方法初步鉴定制备的抗体。结果：目的基因片段c-kit外区正确插入质粒pcDNA3．1，重组质粒免疫小鼠后通过杂交瘤技术获得了三株分泌抗人c-kit胞外区的杂交瘤细胞株6CA、2C5和5D5。其亚类均为IgM类，识别不同的抗原表位，其特异性与抗人c-kit抗体一致。结论：可用基因脾内一次免疫法制备抗人c-kit单克隆抗体。     

基因工程抗体亲和力成熟研究进展

<正>自1975年,Kohler创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来,人们已研制出数以千计的单克隆抗体。单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究,疾病诊断,药物靶向治疗等不可或缺的工具。由于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性,在人体应用时易发生免疫排斥反应,难以有效激发人体免疫效应,而人源的基因工程抗体很好地解决了这一问题。借助DNA重组和蛋白质工程技术,人们可以获得人源单克隆抗体,并可在基因水平对抗体进行拼接、修饰、重新组装成为一种新型抗体。目前美国FDA已批准22种单克隆抗体药物,主要用于肿瘤、病毒和炎症性疾病的治疗,并且现有超过200种单克隆抗体正进行临床试验。     

抗CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备鼠抗人毛细血管形态发生基因2(CMG2)单克隆抗体,并将其初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。方法重组表达CMG2胞外区肽段,免疫Balb/c小鼠,常规制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选目标克隆,制备小鼠腹水并经蛋白A亲和纯化获得相应抗体。间接ELISA法鉴定抗体的亚类类型及亲和力;抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。用候选抗体建立流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹及免疫组织化学方法,初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。结果共获得3株针对CMG2胞外区的杂交瘤细胞株,其中以8F3单克隆抗体的亲和力和特异性最好,亚型为Ig G1。8F3单抗能用于胃癌细胞株CMG2表达的流式细胞术和免疫荧光检测以及胃癌组织的免疫组织化学检测。结论成功制备出高效价高特异性的鼠抗人CMG2单克隆抗体,为CMG2的基础和临床应用研究提供了有用工具。     

人TEM7膜外段单克隆抗体的制备及其在不同来源肿瘤组织中的定位研究

目的　利用制备的抗人肿瘤血管内皮标志物 7(TEM7)单克隆抗体通过免疫组织化学的方法 ,检测TEM7蛋白在不同来源的肿瘤组织中的定位 ,为以TEM7为靶标的肿瘤血管导向治疗提供必要的理论基础。方法　利用PCR的方法 ,将TEM7膜外段重组到原核表达载体pET 32b中 ,在大肠杆菌中表达 ,蛋白经离子吸附层析纯化后免疫雌性BALB/c小鼠 ,传统的杂交瘤融合技术制备鼠抗人TEM7膜外段单克隆抗体。以酶联免疫吸附实验 (ELISA)、Westernblot筛选及鉴定分泌特异性抗人TEM7膜外段单克隆抗体的杂交瘤细胞株。最后采用免疫组织化学ABC的方法 ,分别对不同来源的70例肿瘤组织及癌旁正常组织进行了TEM7蛋白定位的研究。结果　制备了抗人TEM7单克隆抗体 ,经过Westernblot鉴定具有高度的特异性。对肿瘤及癌旁正常组织免疫组织化学ABC染色的结果可见TEM7蛋白定位于 :大肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和前列腺癌的血管内皮细胞 ;大肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和肝细胞癌的肿瘤细胞 ;大肠癌、胃癌和乳腺癌的血管平滑肌细胞 ;胃癌的胃壁平滑肌细胞 ;肝细胞癌的胆管上皮细胞。结论　成功制备了特异性抗人TEM7膜外段的单克隆抗体 ;TEM7在肿瘤组织中并非特异性地表达于肿瘤血管内皮细胞 ,还可见于肿瘤组织的癌细胞、血管平滑     

体外免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合条件的初步观察

单克隆抗体不仅对疾病的诊断,今后对疾病的治疗亦将起到重要作用。但鼠单克隆抗体用于人类疾病治疗会引起过敏反应等问题,因而近年对分泌人类单克隆抗体的杂交瘤或淋巴细胞株的研究越来越多。制备人单克隆抗体过程中的一个重要关键是免疫手段,有许多抗原是不能或不宜给人进行免疫注射的,因此需要建立在体外对正常淋巴细胞进行特异性免疫的方法,并探索利用体外免疫的淋巴细胞进行细胞融合的实验条件。本文对体外免疫的淋巴     

Cys C单克隆、多克隆抗体的制备及临床应用

目的：制备鼠抗人Cystatin C（Cys C）的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法：将PQE30-Cys C转化大肠杆菌BL-21,通过IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA agarose亲和层析纯化Cys C蛋白。通过免疫小鼠和大白兔,制备鼠抗人Cys C的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体。结果：通过构建含Cys C的原核细胞表达质粒,表达及纯化了Cys C重组蛋白,建立了产生抗Cys C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,及制备了兔抗人Cys C的多克隆抗体,末次抗血清效价为1：1000000,经过ELISA证实用CysC免疫的大白兔所制备的抗血清可与Cys C发生特异性的免疫反应。结论：本文成功制备鼠抗人Cys C的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体,建立了ELISA检测Cys C,为用于临床奠定了基础。     

用于定量ELISA方法的抗人β2微球蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)特异性单克隆抗体并建立其双抗体夹心定量ELISA免疫检测方法。方法以高纯度的人β2-MG作为免疫原,采用常规免疫和脾内免疫相结合的方法免疫纯系Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗人β2-MG单克隆抗体并鉴定,以此为基础建立双抗体夹心ELISA检测方法。结果制备出5株稳定分泌抗人β2-MG的单克隆抗体,经鉴定5株单抗皆为IgG1类,均为β2-MG抗原特异性抗体。经抗体配对试验筛选出1对可用于ELISA检测的配对抗体,建立了定量ELISA检测方法。结论制备出抗人β2-MG单克隆抗体并建立了双抗体夹心定量ELISA免疫检测方法,与国外试剂盒检测结果相关性良好。     

抗人凋亡诱导因子单克隆抗体的制备与鉴定

背景：凋亡诱导因子不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。 目的：制备抗人凋亡诱导因子单克隆抗体并进行生物学特性鉴定。 方法：利用Ensembl数据库及DNAstar软件包对凋亡诱导因子氨基酸序列进行分析,获得优势表位多肽,采用碳化二亚胺法将多肽与载体蛋白偶联制备完全抗原免疫动物,采用杂交瘤技术制备凋亡诱导因子单克隆抗体并纯化。 结果与结论：间接ELISA法检测显示,免疫鼠腹水中抗人凋亡诱导因子单克隆抗体效价达到1∶252 400。Western blot结果显示,存在与抗原带一致的相对分子质量67 000的特异条带。免疫组化检测结果显示,在结肠癌组织细胞中有棕色阳性颗粒表达,说明此抗体也可用于免疫组识化学染色。提示实验获得了高活性、高纯度、高特异性抗人凋亡诱导因子单克隆抗体。     

C反应蛋白单克隆抗体的制备及夹心ELISA的建立和应用

目的制备和鉴定抗C反应蛋白(CRP)的单克隆抗体(m Ab)并建立双抗体夹心ELISA。方法应用CRP作为免疫原刺激小鼠,获得抗CRP m Ab后,分组进行交叉配对,建立ELISA,并对肾综合征出血热(HFRS)患者血浆CRP含量进行检测。结果获得12株高亲和力抗CRP特异性m Ab(FMMU-CRP1~FMMU-CRP12)。其中FMMU-CRP7和FMMU-CRP1分别作为包被抗体和检测抗体建立双抗体夹心ELISA,其敏感性达1 ng/m L。ELISA检测发现HFRS患者血浆中CRP含量较正常人明显升高。结论成功制备出抗CRP m Ab,并建立高敏感性ELISA用于CRP检测。