低分子量肝素抑制骨肉瘤LIVIN基因表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的 研究低分子量肝素(LMWH)对骨肉瘤Livin基因表达及细胞凋亡的影响.方法 体外培养骨肉瘤细胞系MG-63,应用MTT法检测不同浓度LMWH不同时间段对骨肉瘤细胞系MG-63生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,SABC免疫组化法分析不同浓度LMWH对骨肉瘤细胞Livin基因表达的影响.结果 LMWH可抑制骨肉瘤细胞系MG-63生长,且随着LMWH剂量的增加,MG-63细胞凋亡率明显增加.免疫组化显示,骨肉瘤细胞系MG-63中LIVIN的表达较用药前明显下降.结论 LMWH对骨肉瘤细胞系MG-63有明显的抑制作用,其作用可能通过抑制抗凋亡基因Livin的表达,促进肿瘤细胞的凋亡而实现.     

分化抑制因子Id1对骨肉瘤细胞增殖的影响

目的探讨分化抑制因子Id1对骨肉瘤细胞增殖的影响及可能的途径。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Id1表达调节后MG-63细胞增殖变化情况;采用流式细胞术检测Id1下调表达后,MG-63细胞凋亡及细胞周期变化情况;Western blotting技术检测Id1下调表达后对p-AKT水平的影响。结果本实验利用RNA干扰技术下调骨肉瘤细胞系Id1表达后,可以明显抑制MG-63细胞的增殖,p-AKT的水平也显示下降,流式细胞术证明下调后Id1的水平可以一定程度地调节细胞凋亡水平,而对细胞周期无明显影响,另外进一步构建了Id1的真核表达质粒,转染Id1过表达质粒后,并未见骨肉瘤细胞明显地增殖加速。结论分化抑制因子Id1可能通过影响AKT信号通路进而影响了骨肉瘤细胞的增殖。     

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞诱导凋亡作用的实验研究

目的：探讨二膦酸盐对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制。方法将人骨肉瘤M G‐63细胞株培养、传代后将细胞分为两组：二膦酸盐400μg／m L干预组、生理盐水空白对照组,孵育72 h后,对两组人骨肉瘤M G‐63细胞株行免疫荧光检测,观察两组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;行流式细胞术检测,观察两组细胞的细胞凋亡率。结果二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG‐63细胞株72 h后,免疫荧光检测结果可见二膦酸盐400μg／mL干预组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas大量表达,而生理盐水空白对照组几乎见不到凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;流式细胞术检测结果观察到二膦酸盐400μg／mL干预组细胞的细胞凋亡率为54．00％,远大于生理盐水空白对照组的细胞凋亡率3．10％,差异有统计学意义（ P＜0．05）,存在明显的诱导凋亡现象。结论二膦酸盐对体外人骨肉瘤M G‐63细胞株存在很强的诱导凋亡作用。     

PTEN基因对K562细胞增殖、凋亡及对Bcl-2和Caspase家族的影响

目的 探讨肿瘤抑制基因PTEN对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的增殖、凋亡及对凋亡相关基因Bcl-2及Caspase-3/7及-9的影响.方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染人慢性粒细胞白血病K562细胞系.通过MTT检测细胞生长曲线,流式细胞仪分析转染效率、细胞凋亡率和细胞增殖指数,同时观察光镜、电镜下细胞形态,DNA ladder、荧光染色等方法检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及Bcl-2 mRNA水平变化,Western Blotting检测PTEN及Bcl-2蛋白变化,应用试剂盒检测Caspase-3/7及-9蛋白活性.结果 以感染复数为200的Ad-PTEN-GFP 转染K562细胞后,最大生长抑制率为37.1%,早期和中晚期凋亡率均高于转染Ad-GFP组和未转染组(P＜0.05),转染PTEN基因3 d后Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平分别是Ad-GFP组的0.27倍和 0.58倍,Caspase-3/7及-9蛋白活性在转染PTEN基因后3 d内呈时间依赖性升高.结论 过表达PTEN基因可能通过抑制抗凋亡分子Bcl-2表达,增强Caspase-3/7及-9活性从而抑制K562细胞系增殖,促进细胞凋亡.     

融合自杀基因抑骨肉瘤生长的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶／胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV-TK／CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法将含TK／CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MC-63细胞,测定感染效率后分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒作用于瘤细胞,测定细胞A值计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342染色法分析其杀伤机制;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组（每组8只）：PBS对照组（A组）;重组腺病毒（Ad）-Lac-Z／GCV＋5-FC组（B组）;Ad-TK／GCV组（C组）;Ad-CD／5-FC组（D组）;Ad-TK／GCV＋Ad-CD／5-FC组（E组）;Ad-TK-CD／GCV＋5-FC组（F组）。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG-63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因作用和双基因相加的作用,且有显著性差异（P〈0．05）;杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。裸鼠实验中,B组与A组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度无明显差异（P〉0．05）;与A、B组相比较,C～F组肿瘤的生长均受到明显抑制（P〈0．05）,且E、F组与C、D比较有显著性差异（P〈0．05）。结论融合自杀基因HSV-TK／CD对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长均有明显的抑制作用。     

补骨脂素对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响

目的 体外观察补骨脂素对人成骨肉瘤MG-63细胞的抑制增殖和促进凋亡作用.方法 将浓度为640、320、160 μmol/L的补骨脂素与MG-63细胞体外培养, 采用苔盼蓝染色法绘制细胞生长曲线,噻唑蓝(MTT)比色法测定药物的细胞毒作用,倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化,Hoechst33258细胞荧光染色法观察细胞凋亡的形态变化.结果 细胞生长曲线表明细胞增殖数量变化与药物浓度及时间有显著依赖性;MTT测定补骨脂素在72 h对MG-63细胞抑制率分别为77.74%、71.05%、61.15%,细胞荧光染色观察到MG-63细胞形态改变.结论 补骨脂素抑制体外培养骨肉瘤MG-63细胞增殖,并可诱导其细胞凋亡.     

冬凌草甲素对骨肉瘤细胞的凋亡诱导效应的研究

目的：考察冬凌草甲素是否能诱导MG-63细胞凋亡。方法：用不同浓度的冬凌草甲素作用于MG-63细胞,用Hochest33258染色鉴定MG-63细胞凋亡的形态学特征;用流式细胞仪分析MG-63早期凋亡细胞的百分率;用Caspase-8蛋白印迹分析证明MG-63细胞凋亡发生的分子特征。结果：凋亡细胞形态学鉴定、流式细胞仪检测均有力证明冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导MG-63细胞凋亡;冬凌草甲素诱导MG-63细胞凋亡伴有Caspase-8蛋白表达上调和裂解激活。结论：冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导MG-63细胞凋亡。     

阻断Notch信号通路抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖的实验研究

目的 探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响及其机制.方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞株;MTT法检测不同浓度DAPT(1.0、5.0、10.0 μmol/L)对骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用;透射电镜下观察不同浓度DAPT对骨肉瘤MG-63细胞形态的影响;流式细胞术结合AnnexinV-FITC/PI双染分析不同浓度DAPT对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响;RT-PCR法检测骨肉瘤MG-63细胞Notch1、HES1基因表达.结果 不同浓度的DAPT作用于骨肉瘤MG-63细胞后,细胞增殖水平明显下降(P＜0.05),1.0μmol/L DAPT即抑制细胞生长,随着DAPT浓度增加抑制效果明显增强,呈显著的浓度依赖关系,且随着DAPT作用时间延长,抑制效果也明显增强.细胞凋亡结果分析表明,DAPT能浓度依赖性地诱导骨肉瘤MG-63细胞发生凋亡.RT-PCR显示随着DAPT量的增加,Notch 1、HES 1 mRNA的表达逐渐下降(均P＜0.05).结论 DAPT对骨肉瘤MG-63细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用可能与下调MG-63细胞中Notch 1、HES 1 mRNA的表达有关.     

PTEN基因对白血病细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨肿瘤抑制基因PTEN对人原代白血病细胞及K562细胞系的增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 将携带有野生型PTEN、绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染原代白血病细胞和K562细胞系.采用MTT法检测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布;光镜和电镜下观察细胞形态;TUNEL等方法检测细胞增殖及凋亡;培养细胞集落并比较不同组间集落形成的数量;实时荧光定量PCR(FQ-PER)检测PTEN mRNA水平变化,Westernblotting检测PTEN蛋白水平变化.结果 以感染复数为200转染后,与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP转染人白血病K562细胞系后,细胞增殖受抑,凋亡率增加,最大生长抑制率为35.2%,最大凋亡率为30.0%.细胞周期显示G1期阻滞,G0/G1期细胞比例增加[(54.9±2.51)% vs (78.5±4.13)%],G2/M期比例降低[(30.2±1.91)% vs (13.6±1.02)%](均P<0.05).结论 过表达PTEN可以抑制白血病细胞增殖,促进细胞凋亡,并导致细胞周期阻滞在G0/G1期.     

抑癌基因PTEN对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响

目的探讨外源性PTEN基因稳定转染对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。方法应用质粒pCMV-Tag3B-PTEN和pCMV-Tag3B空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人骨肉瘤细胞株MG-63,以未转染组为对照。应用RT-PCR分析目的基因表达,MTT法分析细胞生长增殖,An-nexinV—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,荧光染色法观察细胞形态。结果pCMV-Tag3B-PTEN转染组有外源目的基因的整合和相应mRNA表达。MTT检测表明,pC-MV-Tag3B-PTEN转染组转染组活细胞数低于未转染组和pCMV-Tag3B细胞转染组。流式细胞术显示pCMV-Tag3B-PTEN转染组凋亡率高于未转染组和pCMV-Tag3B细胞转染组。荧光染色观察到pCMV-Tag3B转染组部分细胞呈现典型的凋亡细胞形态。结论外源性PTEN基因稳定转染可诱导人骨肉瘤细胞凋亡。     

磁性阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的合成及其对MG-63人骨肉瘤细胞的效应

目的:利用FeCl2.4H2O、FeCl3.6H2O、α-氰基丙烯酸正丁酯、盐酸阿霉素等试剂合成磁性阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的稳定胶体液,并研究其对MG-63型人骨肉瘤细胞的作用。方法:①用FeCl2.4H2O、FeCl3.6H2O、盐酸阿霉素、α-氰基丙烯酸正丁酯等试剂合成磁性阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒。②在透射电镜下观察纳米粒的物理形态;用振动样品磁强计检测纳米粒的饱和磁化强度;用紫外分光光度计测定药物的包封率、载药量。③用扫描电镜观察、MTT法和流式细胞仪测定法检测其对MG-63型人骨肉瘤细胞的作用。结果:利用FeCl2.4H2O、FeCl3.6H2O、盐酸阿霉素、α-氰基丙烯酸正丁酯等试剂成功合成了一种稳定的棕色胶体溶液;透射电镜下观察,形态近似于球形,分散度好,平均直径184.60 nm;振动样品磁强计检测胶体中纳米粒的饱和磁化强度为0.558 emu/g,紫外分光光度计等仪器测定药物的包封率为90.73%,载药量为10.68%;通过扫描电镜、MTT法和流式细胞仪测定法检测,表明该胶体溶液较ADM对MG-63人骨肉瘤细胞有更强的抑制作用。结论:该胶体溶液性质稳定,药物颗粒不超过300 nm,理论上可以在动物血管中随循环流动而不会沉淀;该纳米粒的饱和磁化强度为0.558 emu/g,微粒可被4 250 Gs的磁场所吸引,以达到磁靶向的效应;药物的包封率为90.73%,载药量为10.68%,表明药物合成的效率较好;且该胶体溶液较ADM对MG-63人骨肉瘤细胞有更强的抑制作用,为下一步动物实验提供了基础。     

虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响及其机制研究

目的 研究虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响及其机制。方法 采用CCK-8实验检测不同浓度虫草素作用于MG-63骨肉瘤细胞24h和48h后对癌细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞术分析虫草素对MG-63细胞周期分布及凋亡的影响;采用Western blot法检测虫草素对MG-63细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及NICD1、Hes1蛋白表达的影响。结果 虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞有明显的增殖抑制作用,导致MG-63细胞周期阻滞于G₀/G₁期并诱导细胞凋亡;虫草素可上调Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白的表达并下调Bcl-2,NICD1和Hes1蛋白的表达。结论 虫草素通过抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导细胞周期阻滞于G₀/G₁期并通过线粒体凋亡途径诱导MG-63细胞凋亡从而发挥抗骨肉瘤作用,可能骨肉瘤细胞中Notch信号通路活性下调有关。     

PTEN基因及其在甲状腺癌中的研究

大约有4%～7%的人口在他们的一生中会形成临床上明显的甲状腺结节,大多数情况下术前诊断通过针吸活组织检查(Needle Biopsy)是不确定的。因此,对甲状腺良恶性肿瘤的诊断检测的改进成为迫切的需求。PTEN基因是新发现的抑癌基因,在大量的实验研究中已经证实。它的失活或突变与人类多种肿瘤的发生、发展及预后有关。对于PTEN基因在甲状腺肿瘤中的研究,成为目前研究的焦点。     

PTEN基因对血管平滑肌细胞影响的研究进展

再狭窄严重制约了经皮冠状动脉介入治疗的远期疗效。其病理基础是新生内膜的形成;而血管平滑肌细胞增殖和迁移则是其主要成因。PTEN是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响。近年来,对PTEN的研究逐渐从肿瘤领域延伸到一些非肿瘤领域中,随着研究的深入,人们发现其在再狭窄、心肌肥大、高血压、动脉粥样硬化中也发挥重要的作用。     

三羟异黄酮上调肝癌HepG2细胞PTEN基因的表达及其诱导凋亡作用

 【目的】探讨三磷酸肌醇（IB）和PTEN蛋白变化在三羟异黄酮（genistein）诱导肝癌细胞凋亡中的作用。【方法】以肝癌HepG2细胞培养72h为对照组，实验各组以60Ixmol／L三羟异黄酮作用于HepG2细胞不同时间后，应用同位素试剂盒检测细胞嵋含量，Western blot分析细胞PTEN蛋白表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。【结果】对照组Ib含量为（29．2±0．6）pmol／10^6 cells，PTEN蛋白与内参actin蛋白灰度和面积之积的比值V-PTEN／V-actin为0．12±0．00；细胞凋亡率为（2．6±0．1）％。三羟异黄酮作用于肝癌HepG2细胞12、24、48、72h后珉分别为（12．0±1．4）pmol／10^6cells，（7．5±0．8）pmol／10^4 cells，（5．6±0．5）pmol／10^6cells，（3．3±0．6）pmol／10^6 cells；V-PTEN，V-actin分别为13．13±0．20，19．17±1．09，28．51±2．18，41．12±3．80；细胞凋亡率分别为（2.7±0．2）％。（7．4±0．5）％，（20．5±2．0）％，（30．7±1．6）％。与对照组比，三羟异黄酮作用于肝癌HepG2细12h后各时相珉显著降低（P〈0．01），PTEN蛋白表达显著增高（P〈0．01），24h后各时相细胞凋亡率显著增高（P〈0．01）。【结论】三羟异黄酮能减少瑕生成，上调PTEN基因表达，诱导肝癌细胞凋亡。     

大豆苷元对前列腺癌细胞及PTEN基因的影响

目的:通过观察大豆苷元对前列腺癌细胞(PC-3)增殖和相关基因表达的影响,探讨通过膳食干预途径预防前列腺癌发病的可行性。方法:将PC-3在F12培养基(含10%小牛血清)中采用开放式单层贴壁培养,实验设溶剂对照组、受试物各六个剂量组,采用MTT法对PC-3的增殖情况进行分析,对大豆苷元作用后的雄激素非依赖型前列腺癌(PC-3)细胞的存活率、细胞毒作用进行了研究。结果:与溶剂对照组相比,大豆苷元对PC-3细胞抑制效应均具有剂量依赖性,具有诱导凋亡和引起坏死效应,同时能诱导PC-3细胞的(PTEN基因)表达。结论:大豆苷元具有明显抑制前列腺癌细胞PC-3增殖效应,并呈现剂量-效应关系。     

NS398诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡及对bcl-2蛋白表达的影响

目的研究环加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂NS398抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖及诱导其凋亡的效应和机制。方法MTT比色法观察NS398的细胞毒性作用及其浓度依赖性；透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化；琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成。流式细胞仪检测细胞凋亡率及与NS398作用时间的关系；Western blot测定bcl-2蛋白表达。结果不同浓度（0.1～100μmol／L）NS398均可使细胞生长受到抑制；电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学变化；琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成；流式细胞术检测证实细胞凋亡率与NS398作用时间呈明显相关。Western blot检测显示随着NS398作用时间延长，可不同程度地降低bcl-2蛋白表达。结论NS398能抑制人MG-63细胞增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与调控bcl-2蛋白表达有关。     

二磷酸盐对成骨细胞增殖及分化成熟作用的实验研究

目的研究二磷酸盐类药物—阿伦磷酸对成骨细胞增殖及分化成熟的作用。方法将人成骨样MG-63细胞体外培养、传代后分为5组:空白对照组、阳性对照组(加入10-8M地塞米松)、3个实验组(分别加入10-6M、10-8M、10-10M阿伦磷酸)。培养数日后,行细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨形态发生蛋白-(2BMP-2)、骨钙素(OC)、I型胶原(Coll.I)基因表达等检测。结果加入阿伦磷酸的3个实验组MG-63细胞数目较对照组显著增加,其峰值出现在浓度为10-8M时;同时,阿伦磷酸使ALP活性增强,而且BMP-2、OC、Coll.I等成骨细胞相关基因的表达增加。结论阿伦磷酸具有促进成骨细胞增殖及分化成熟,诱导骨形成的能力。