胸苷激酶基因治疗人多形性胶质母细胞瘤BT325并诱导BT325和9L肿瘤细胞的凋亡

目的：了解转单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）前后胶质瘤细胞对更昔洛韦（ＧＣＶ）的药物敏感性；钙通道阻滞剂尼莫地平是否增强ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗的肿瘤杀伤作用，以及该治疗方法能否诱导胶质瘤细胞凋亡。方法：用带有ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因的重组逆转录病毒载体，转染人多形性胶质母细胞瘤株ＢＴ３２５。用ＭＴＴ法测定ＧＣＶ对转染ＨＳＶ－ＴＫ基因ＢＴ３２５瘤细胞的杀伤作用。结果：０．１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ对转ＨＳＶ－ＴＫ基因的ＢＴ３２５瘤细胞有杀伤作用，加入尼莫地平后，０．０１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ即有杀伤作用。同时发现该治疗方法可以引起胶质瘤细胞的凋亡。结论：ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗对胶质瘤有很强的杀伤作用，并可以引起肿瘤细胞的凋亡；尼莫地平有协同作用，这可能使尼莫地平做为一种增敏剂在脑肿瘤该治疗中使用。     

胶质瘤多药耐药细胞系C6／adr的建立及其耐药性逆转的研究

目的 研究胶质瘤多药耐药（ＭＤＲ）的发生机理及逆转方法。方法 建立了Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系,经ＲＴ－ＰＣＲ及免疫组化染色分别研究了ｍｄｒ－１基因及Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的表达;采用ＭＴＴ药敏试验及ＨＰＬＣＡ测定细胞内阿霉素浓度的方法研究了异搏定、红霉素、潘生丁、Ｐ－ｇｐ单克隆抗体、复方丹参对ＭＤＲ的逆转作用。结果 Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系ｍｄｒ－１基因阳性,Ｐ－ｇｐ高度表达。异搏定（２～６μ     

MDR1基因及P—gp在脑胶质瘤中定量表达的研究

目的检测脑胶质瘤中多药耐药基因ＭＤＲ１、ｍＲＮＡ和膜糖蛋白Ｐ－ｇｐ相对含量，确定胶质瘤的化疗敏感性。方法免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）。结果在非化疗组和短期化疗组ＭＤＲ１ｍＲＮＡ含量及Ｐ－ｇｐ表达无显著差别，但长期化疗组明显高于前两组。结论推测ＭＤＲ１基因过度表达可能是胶质瘤继发耐药的主要原因。Ｐ－ｇｐ的表达程度与ＭＤＲ１ｍＲＮＡ含量相关     

老年急性脑血管病并多器官功能衰竭患者SIL—2R和T细胞亚…

采用ＥＬＩＳＡ和ＡＰＡＡＰ法对３２例老年急性脑血管病（ＡＣＶＤ）并多器官功能衰竭（ＭＯＦ）患者及４０例老年和３５例非老年ＡＣＶＤ患者血清可溶性白细胞介素２受体（ＳＩＬ－２Ｒ）及Ｔ细胞亚群水平进行了测定。并与３０例对照组比较。结果显示，疾病各组队ＣＤ３外ＳＩＬ－２Ｒ和ＣＤ８均较对照组明显升高ＣＤ４／ＣＤ８比值则明显下降，其中以老年ＡＣＶＤ并ＭＯＦ组变化最为显著，与老年和非老年ＡＣＶＤ组比较，亦有显著     

逆转录病毒载体介导中国单疱病毒TK基因转导脑胶质瘤细胞

目的：研究载中国单疱病毒胸苷激酶基因逆转录病毒重组体（ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ）和羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）体外转染和杀伤脑胶质瘤效果，探索应用该系统基因治疗脑胶质瘤。方法：ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ重组体病毒感染胶质瘤细胞，Ｇ４１８筛选转染阳性胶质瘤细胞克隆。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测抗Ｇ４１８胶质瘤细胞中的ＴＫｃ基因表达。药物敏感实验观察ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的毒性反应。结果：１．０ｍｇ／ｍｌＧ４１８筛选１０～１４天获抗性胶质瘤细胞克隆；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示抗Ｇ４１８细胞ＴＫｃ基因明显表达；ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ高度敏感，其ＥＤ５０为：Ｃ６ＴＫｃ０．０２μｇ／ｍｌ，Ｕ２５１ＴＫｃ０．００６μｇ／ｍｌ，Ｕ８７ＴＫｃ０．００４μｇ／ｍｌ，ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的敏感性是非转基因胶质瘤细胞的５００倍以上。结论：载中国ＴＫｃ基因逆转录病毒重组体可有效转染脑胶质瘤细胞并使其对ＧＣＶ高度敏感，该系统可望用于脑胶质瘤的基因治疗。     

瞬目反射,脑干听觉诱发电位,经颅多普勒超声对椎基底动脉供血不？…

目的：观察瞬目反射（ＢＲ），脑干听觉诱发电位（ＢＡＥＰ），经颅多普勒超声（ＴＣＤ）对椎基底动供血不足（ＶＢＩ）的诊断意义。方法；对４１例已经临床确诊的ＶＢＩ病人在间歇期进行ＢＲ，ＢＡＥＰ及ＴＣＤ检查，结果：ＴＣＤ，ＢＡＥＰ异常率分别为８３％，８０％，６８％，ＢＲ提示病人脑桥损害１例，延髓损害１５例，广泛性脑干损害１７例；ＢＡＥＰ发现内耳听力减退２０例，脑干病变１３例，ＴＣＤ发现多血管流速异常１４例     

腺病毒介导的HSV—tk基因治疗大鼠脑胶质瘤实验研究

目的：带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组腺病毒（ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ）结合核苷类似物（ＮＡ）治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法：用Ｘ－ｇａｌ染色测定ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ转染大鼠Ｃ６胶质瘤细胞的效率。用ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ、ＧＣＶ离体及活体治疗大鼠Ｃ６胶质瘤。结果：ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ感染Ｃ６细胞效率达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ感染Ｃ６细胞，在病毒感染复数为１０００时，ＧＣＶ和ＡＣＶ半致死剂量分别为３μｇ／ｍｌ和２０μｇ／ｍｌ，Ａｄ－ＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ治疗大鼠Ｃ６胶质瘤模型，大鼠生存期超过９０天，而对照组分别为１７．０±１．６天（生理盐水组）、１４．５±１．３天（ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ组），Ｐ＜０．００１。结论：重组腺病毒对靶细胞感染效率可达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ用ＧＣＶ的杀伤Ｃ６胶质瘤细胞比ＡＣＶ强，而ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ用腺病毒介导治疗大鼠脑肿瘤疗效显著。     

胸苷激酶基因治疗人多形性胶质母细胞瘤BT325并诱导BT325和…

了解转单纯疱疹病毒胸苷激基因前后胶质瘤细胞对更昔洛韦的药物敏感性；钙通道阻滞剂尼莫地平是否增强ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗的肿瘤杀伤作用，以及该治疗方法能否诱导胶质瘤细胞凋亡。方法：用带有ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因的重组逆转录病毒载体，转染人多形性胶质母细胞瘤株ＢＴ３２５。     

cAMP类似物对人恶性胶质瘤细胞BT325增殖与分化的影响

目的：观察ｃＡＭＰ类似物８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人恶性胶质细胞ＢＴ３２５增殖分化的影响。方法：在人恶性胶质瘤细胞ＢＴ３２５中加终浓度为１０－５ｍｏｌ／Ｌ的８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ体外培育２４ｈ后，应用酸解ＤＮＡ及甲绿派洛宁染色技术在同一标本上鉴别增殖型细胞和分化型细胞。结果：８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ处理组增殖型细胞占６７％，分化型细胞占３３％；而对照组增殖型细胞占８５％，分化型占１５％。结论：８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对     

IL-4基因修饰抗人脑胶质瘤效应的体外研究

目的 探讨人ＩＬ－４基因修饰对人脑胶质瘤的抑瘤效应及可能机制。方法 以逆转录病毒载体将人ＩＬ－４基因导入人脑胶质瘤细胞系ＳＨＧ４４细胞，用３Ｈ掺入法及流式细胞仪分析ＩＬ－４基因转染对人脑胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响；＾３Ｈ掺入法、＾５１Ｃｒ释放法检测ＩＬ－４基因修饰瘤苗对健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖、细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）反应的影响。结果 与野生型瘤细胞比较，ＩＬ－４基因修饰瘤细胞增     

Reversion of multidrug resistance in human glioma by RNA interference

OBJECTIVE: To explore whether the vector construction of short hairpin in vivo could make human glioma cell line BT325 produce RNA interference (RNAi) duplexes and reverse the expression of the MDR1 gene. METHODS: Three 62nt oligonucleotide fragments (shRNA) were constructed according to GeneBank MDR1 sequence and were cloned to the retrovirus-delivered vectors. After these vectors were transfected directly to the BT325 cell by Lipofectamine 2000 with enhanced green fluorescent protein (EGFP) co-transfection, the MDR1 gene silence effects were detected by the changing levels of mRNA and P-glycoprotein (P-gp) including real-time PCR (RT-PCR), Northern blot and Western blot analysis. For assessing multidrug resistance against doxorubicin (DOX) and vincristine (VCR), cell proliferation assays were performed by cell counting kit-8 and IC50 was calculated. RESULTS: The RNAi plasmid vectors were constructed successfully. The gene silence became the strongest after 48 hour transfection from Northern blot; Western blot analysis demonstrated that P-gp expression reduced to 12.9, 30.3 and 4.8%. The chemosensitivity assays showed that the transfected cell could increase the sensitivity of DOX and VCR. Based on the value of IC50, BT325 cells increased sensitivity to drugs obviously. The sequence specific RNAi could inhibit MDR1 mRNA and P-gp expression of the glioma cell line. And it may reverse multidrug resistance phenotype, which may provide promising therapeutic modalities in the treatment of human glioma.     

神经胶质瘤C6/VP16多药耐药细胞株的建立

目的建立神经胶质瘤C6细胞对依托泊苷(VP16)耐药细胞株C6/VP16,探讨其耐药的可能机制。方法采用浓度递增和短期大剂量药物诱导相结合的方法建立大鼠C6/VP16耐药细胞株;光镜下观察C6/VP16细胞株的形态学变化;细胞计数试剂盒-8检测C6/VP16细胞株对VP16、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、环磷酰胺(CTX)、替莫唑胺(TMZ)的耐药敏感性;westernblot检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达量变化。结果经过65代诱导培养,成功建立可操作的、重复性好的C6/VP16耐药细胞株。C6亲代细胞形态规则、大小均一,生长迅速,紧密生长,每2～3d传代;C6/VP16细胞株,突起增多,生长周期受抑制,生长变缓,每10～12d传代。VP16、TMZ、CTX、ADM和VCR作用C6亲代细胞的半生长抑制浓度(IC50)分别为(0.105±0.043)、(27.284±0.529)、(5.800±0.317)、(6.636±0.315)和(19.146±0.526)μg/ml,而作用C6/VP16细胞株的IC50分别为(0.943±0.052)、(33.251±0.288)、(32.943±0.215)、(35.251±0.126)和(35.604±0.426)μg/ml;VP16、CTX和ADM作用C6/VP16细胞株IC50较C6亲代细胞差异显著(P<0.05)。C6/VP16细胞株MRP1的表达量较亲代C6细胞明显增加(P<0.05)。结论 C6/VP16细胞株对ADM和CTX存在明显交叉耐药,而对TMZ和VCR无明显交叉耐药;多药耐药性是多种机制相互作用的结果,MRP1可能参与其中。     

siMDR1基因转染人类BT325胶质瘤细胞系的表达

目的探讨siMDR1基因转染人类胶质母细胞瘤细胞BT325后细胞的表达能力。方法设计并合成siRNA质粒,取培养对数期生长良好的胶质母细胞系BT325,传代培养。将阳离子脂质体(Lipofectamine 2000)和质粒MDR1 DNA按比例共转染。瞬时对转染成功的细胞系应用抗性药物-嘌呤霉素进行筛选,筛出稳定的细胞系后,分别在荧光显微镜下分析转染情况。通过免疫细胞化学染色及图像分析对瞬时转染和稳定转染的BT325细胞进行检测,确定MDR1基因产物P-糖蛋白(P-gp)表达水平。阿霉素对瞬时转染及稳定转染的BT325耐药性进行分析。结果成功构建了逆转录病毒si RNA质粒载体,经过瞬时转染BT325细胞生长状态良好,48h表达绿色荧光最强。加入嘌呤霉素筛选后,在第8天出现单细胞克隆。免疫细胞化学染色证实瞬时转染与稳定转染BT325细胞P-gp的表达下降。细胞的转染效率为70%～80%。BT325细胞经过RNA干扰,细胞对MDR1耐药性明显下降,IC_(50)降低,细胞的耐药因子(RF)有所升高。结论siMDR1基因瞬时转染和稳定转染都可以抑制P-gp蛋白的表达,其可以作为基因治疗的重要手段。     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。     

反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤多药耐药细胞株中Pgp相关基因表达的实验研究

目的通过研究反义寡核苷酸对大鼠胶质瘤多药耐药细胞株C6/adr中Pgp相关基因表达的抑制作用,探讨寡核苷酸在细胞内的代谢过程。方法根据MDR-1基因序列合成反义寡核苷酸转染胶质瘤耐药细胞,应用RT-PCR、流式细胞仪等方法,分别在转染后6、12、24、48h对其进行MDR-1mRNA水平及Pgp含量的检测。结果流式细胞及RT-PCR结果显示转染后6h即可发现胶质瘤耐药细胞Pgp和MDR-1mRNA减低,减低程度与转染后的检测时间相关,12~24h减低程度最为显著(P<0.05),48h后恢复至转染前的水平。结论反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤细胞的Pgp表达和减低MDR-1mRNA水平具有明显的细胞内的代谢过程,了解其作用的规律性有助于选择适宜的用药时机,更大限度地提高疗效。     

脑胶质瘤耐放射细胞亚株的建立方法

目的探索诱导并建立脑胶质瘤耐放射细胞亚株的体外实验方法,为进一步研究胶质瘤放疗抵抗发生的分子生物学机制提供基础。方法以脑胶质瘤U251细胞株为实验对象,通过体外细胞培养,应用60Co射线对脑胶质瘤U251细胞株进行小剂量重复的诱导照射,得到U251耐放射细胞亚株RR-U251。观察RRU251细胞形态的变化;MTT检测其细胞活力,流式细胞仪(FCM)检测其细胞凋亡;集落形成实验检测细胞克隆团形成。结果放射治疗后,RR-U251与U251细胞的相比:细胞增殖活力增强11.5%,迁移能力增强50%,侵袭能力增强87.5%,凋亡率下降69.6%,细胞集落形成率升高88.5%;RR-U251放射敏感性明显下降。结论小剂量重复照射诱导法能较好地建立胶质瘤耐放射细胞亚株RR-U251。     

反义寡核苷酸逆转大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)上特异位点的反义寡核苷酸对体外培养的大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的逆转作用。方法根据MDR-1基因的碱基序列设计合成硫代修饰的寡核苷酸,通过阳离子脂质体介导转染胶质瘤耐药细胞,应用流式细胞仪、RT-PCR等方法,对转染后的耐药细胞进行P-170、MDR-1mRNA水平的检测;用MTT法对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价寡核苷酸对多药耐药性的逆转效果。结果流式细胞结果显示转染后胶质瘤耐药细胞P-170表达明显低于转染前(P<0.05);RT-PCR可见转染后细胞的MDR-1mRNA水平减低;药物敏感性试验显示反义寡核苷酸转染后胶质瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性增强(P<0.05),含有脂质体的转染体系组对化疗药物的敏感性显著高于不含脂质体的转染体系组(P<0.01)。结论特异序列的反义寡核苷酸能够明显抑制大鼠胶质瘤细胞的P-170表达和减低MDR-1mRNA水平,进而对胶质瘤细胞的多药耐药性产生明显的逆转作用;应用阳离子脂质体作为转染载体可显著提高转染效率。     

MGMT反义RNA对人脑胶质瘤耐药性逆转的研究

目的 利用反义技术逆转胶质瘤的耐药性。方法 模拟临床亚硝基脲类药物的用药程序，在体外建立由DNA修复蛋白O^6－甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）介导的人脑胶质瘤耐药细胞系U251－BCNU，并行细胞药性检测和细胞MGMTmRNA表达的分析，观察MGMT反义RNA对U251/BCNU细胞MGMT表达的调节作用及对U251／BCNU细胞BCNU敏感性的影响。结果 经过反复总共5次的用药过程，首次在体外建立了对BCNU具有稳定抗性的U251／BCNU，其对BCNU的耐受程度约为U251的17倍；RT－PCR结果显示，U251／BCNU细胞有MGMTmRNA的表达。MGMT反义RNA表达载体 LMT5SN和pLaMTSN能够在一定程度上降低U251／BCNU细胞中MGMT mRNA的表达水平，提高其对BCNU的敏感性。结论 MGMT反义RNA能够在一定程度上抑制MGMT的表达水平，提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性。     

人脑胶质瘤多药耐药细胞株的构建及生物学特性鉴定

目的 体外构建胶质瘤耐甲磺酸伊玛替尼多药耐药细胞株,并研究其生物学特性。方法采用逐渐增加培养基中伊玛替尼药物浓度的方法诱导构建耐甲磺酸伊玛替尼的人脑胶质瘤U251细胞株(命名为U251 AR); CCK8法检测U251AR、U251对多种化疗药物的IC50和耐药指数;QRT-PCR法检测耐药相关基因ABCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA的表达,流式细胞术检测ABCG2蛋白的表达。 结果 体外培养12个月后建立了稳定耐药的细胞株U251AR,与亲代细胞相比异形性不显著。U251和U251AR对化疗药物的IC50相比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,U251AR对甲磺酸伊玛替尼、阿霉素、顺铂的耐药指数分别为20.41、5.06、10.28,表现出多药耐药特征。QRT-PCR检测结果显示耐药细胞株U251AR中ABCC1、ABCB1、ABCB4、ABCG2 mRNA的表达明显高于亲代U251细胞,流式细胞术检测结果显示U251AR中ABCG2蛋白的表达强于亲代U251细胞,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 成功建立多药耐药的胶质瘤细胞株U251AR,其多药耐药与A BCC1、A BCB1、A BCB4、A BCG2 mRNA及ABCG2蛋白的表达上调相关。