天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类激素诱导为神经细胞的研究

目的:体外诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法:SD大鼠股骨骨髓细胞体外扩增。用肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素注射液分别加入无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经细胞。免疫细胞化学鉴定有神经元烯醇化酶(NSE)、神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞在体外扩增5-22代,对照组不加任何诱导剂,有53%的神经样细胞。加入肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素诱导1-5h,约70%MSC形态转变为典型的神经样细胞。免疫细胞化学显示诱导出的神经样细胞NSE、nestin、GFAP表达阳性。继续培养5d后对照组神经样细胞逐渐凋亡。肾上腺素类各组虽存活6d,但细胞正常形态改变,部分细胞死亡漂浮。一瓶MSC在正常培养至第7代时,自发出现约50%的神经细胞,传至第13代,有约60%的神经细胞(66.5%±6.4%)。结论:骨髓本身可能存在着神经干细胞。大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类诱导可分化为多种形态的神经细胞。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后免疫原性研究

目的:通过体外天麻诱导人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)向神经元样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后细胞的免疫原性.方法:通过贴壁法分离hMSCs,体外扩增培养.天麻定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式细胞术(FCM)检测分化后细胞HLA-DR表达,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测神经细胞分化的hMSCs是否引起人外周血淋巴细胞增殖反应(Human peripheral blood lymphocytes,hPBLs).结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.天麻诱导3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.流式细胞术显示hMSCs向神经细胞分化后HLA-DR表达阴性,混合培养结果也显示分化hMSCs不引起hPBLs增殖反应.结论:天麻可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs不引起人淋巴细胞增殖反应,具有低免疫原性.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：研究表明,移植后的骨髓间充质干细胞在新的环境中能够被诱导分化为神经元样细胞,从而替代损伤细胞重建神经环路。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞和神经细胞的体外共培养系统,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 方法：体外培养Wistar大鼠脑组织神经细胞和股骨骨髓间充质干细胞,采用Transwell小室共培养分化诱导,观察骨髓间充质干细胞的组织形态变化,在共培养第5天免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经细胞的特异标志物;与对照组单纯骨髓间充质干细胞培养结果相比较。 结果与结论：神经细胞共培养系统中的骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状,互相形成连接,特异性烯醇化酶显示阳性结果,具有神经元样细胞的特性,表达特异性烯醇化酶阳性的神经元比例可达(33.0±10.5)%。而对照组骨髓间充质干细胞未形成神经元样细胞的形态结构,免疫荧光显示特异性烯醇化酶阴性。提示神经细胞提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞具有诱导分化作用。      

灯盏花素注射液对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探索灯盏花素注射液体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性。方法贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞。第4代细胞行表型鉴定后,用灯盏花素注射液诱导,每6h倒置相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞的神经元特异性稀醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测不同浓度灯盏花素注射液诱导后细胞的活力,流式细胞术及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP mRNA的表达变化。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,诱导18h后BMSCs胞体开始收缩,有突起伸出,24h后突起增多形成网络结构。免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(48.7±3.4)%,GFAP阳性表达为(56.8±4.2)%,流式细胞仪检测诱导24h后的细胞NSE及GFAP蛋白表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP mRNA,未诱导的细胞则不表达。结论灯盏花素注射液可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞。     

葛根素对骨髓间充质细胞的诱导分化

目的探索葛根素体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(Bone Marrow Stromal Cells MSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性,为中药在细胞定向分化中的应用提供理论和实验依据.方法用贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞.培养传至第5代,诱导组以2.5mg/ml的葛根素预诱导24h后,用17.5mg/ml的葛根素无血清培养基诱导,未诱导组加入等量培养基,24 h后相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后的细胞神经元特异性稀醇化酶(neuronspecific enolase NSE),神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)蛋白的表达情况,MTT检测不同浓度葛根素诱导后细胞的活力,流式细胞仪及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP的表达情况.结果诱导18h后BMSCs胞体收缩,有突起伸出,24 h后突起增多呈网状.免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(53.3±4.3)%,GFAP阳性表达为(64.5±5.2)%,流式细胞仪检测诱导24 h后的细胞NSE及GFAP表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP,未诱导的细胞则不表达.结论葛根素可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞.     

麝香多肽体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的研究

目的:观察麝香多肽体外定向诱导成年大鼠和人骨髓间质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)分化为神经元的能力。方法:采用含100-150mg/L麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元,免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经巢蛋白(nestin)的表达。结果:成年大鼠和人BMMSCs在加入含麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导后,BMMSC胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:麝香多肽可以在体外诱导成年大鼠和人BMMSCs定向分化为神经元。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景:文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见。目的:建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。结果与结论:分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%。结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达

目的分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法用丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后90mins,提取诱导前后的骨髓基质干细胞总RNA,RT-PCR检测ngn-1,mash-1的表达及观察其诱导前后的表达情况,免疫组化检测NSE和GFAP的表达情况。结果未经诱导的骨髓基质干细胞ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应。结论骨髓基质干细胞向神经元样的分化与ngn-1,mash-1可能有关。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45。采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化。免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显。GFAP在诱导10d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10dNestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达。结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化蛋白的表达

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外神经分化蛋白的表达。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓MSCs。取生长状态良好的第1、3、7代细胞绘制生长曲线,免疫细胞化学法鉴定其性质,检测巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果细胞传代后1-2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6d进入平台期。免疫细胞化学法鉴定大鼠骨髓MSCsCD44呈阳性,CD34呈阴性,nestin、NSE、MAP2、GFAP、TH均呈不同程度的阳性表达,其阳性表达率分别为(25.5±5.6)%、(14.2±2.1)%、(1.4±0.5)%、(4.5±1.2)%、(3.6±1.2)%。结论大鼠骨髓MSCs在体外能自发地表达神经干细胞和神经细胞的某些标志蛋白,这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子和5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞分化潜能和细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和5-氮杂胞苷(5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,在倒置相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期改变;MTT法检测bFGF和5-aga对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测actin、desmin、myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化;MSCs经5-aza以及5-aza加bFGF联合诱导actin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高;而经bFGF诱导后,前4种蛋白表达无明显变化,仅GFAP蛋白表达显著增高。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,而bFGF有明显促增殖作用。MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞,bFGF可使MSCs分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。     

人脐血MSCs向神经元样细胞分化过程中neurogenin1的表达变化

目的: 探讨人脐血间质干细胞(MSCs)体外向神经元样细胞分化过程中neurogenin 1的表达变化。方法: 常规从人脐血中分离MSCs,采用生长因子EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测诱导前、后神经元表面标志蛋白NF-M、NSE、胶质细胞标志蛋白GFAP和neurogenin 1的表达情况;Western blotting和RT-PCR法检测诱导前、后人脐血MSCs中neurogenin 1蛋白和mRNA的表达变化。结果: 诱导前,人脐血MSCs不表达NF-M、NSE和GFAP;诱导7 d,人脐血MSCs可以分化为神经元样细胞, 同时表达NF-M、NSE和GFAP。诱导前,人脐血MSCs不表达neurogenin 1,诱导后neurogenin 1蛋白和mRNA表达显著增加。结论: Neurogenin 1可能参与了体外诱导人脐血MSCs向神经细胞分化的过程。     

大鼠骨髓间质细胞向Schwann-like细胞的诱导分化

目的探索成年大鼠骨髓间质细胞(MSCs)向Schwann—like细胞转化的方法和机理。方法分别用变性神经提取液和含有大鼠白血病抑制因子(rLIF)、上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的诱导液诱导成年大鼠骨髓间质细胞,观察诱导过程中细胞形态学变化,利用免疫细胞化学染色鉴定诱导细胞性质;同时培养大鼠Schwann细胞作为对照。结果经变性神经提取液诱导后细胞转化为梭形细胞,并排列成网状;经细胞因子诱导后细胞呈梭形排列,S-100,GFAP染色呈阳性反应。结论变性神经提取液中含有促使骨髓间质细胞向Schwann-like细胞分化的必要成份;LIF可能是这些必要成份的重要组成之一。     

氯化锂通过调节自噬通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:研究氯化锂(Li Cl)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)神经分化的影响,并探讨自噬通路在其中的作用。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞分为Li Cl组和对照组,采用β-巯基乙醇诱导MSCs向神经细胞分化,免疫荧光法和Western blot法检测诱导后神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化。进一步采用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预自噬,Western blot法观察NSE和MAP-2的表达变化。结果:诱导分化后,Li Cl组及对照组细胞均有NSE和MAP-2表达,Li Cl组细胞NSE和MAP-2蛋白阳性表达率及表达量均大于对照组(P0.05);此外,Li Cl组细胞LC3阳性荧光点以及LC3-Ⅱ表达量亦多于对照组(P0.05)。加用雷帕霉素可进一步促进Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05),而3-MA则抑制Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05)。结论:氯化锂可能通过调节自噬通路促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的表型变化

为了研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化为神经细胞的表型特征,利用贴壁培养法获得骨髓MSCs。化学诱导剂二甲基亚砜(DMSO)和β-巯基乙醇(BME)联合诱导MSCs。免疫组织化学染色检测神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF的表达,以及胶质细胞标志物GFAP的表达。硫堇-伊红染色检测细胞内Nissl体。结果表明,DMSO和BME联合诱导MSCs后48h,80%以上的细胞变为神经元样形态,胞体发出数个突起,有的似轴突,突起交织成网。免疫组化结果表明,诱导后细胞表达神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF,其诱导率分别为88.6%,87.1%和85.8%。神经干细胞的特征性生物学标记nestin的诱导率在诱导后2h和10h较高,分别为48%和71.4%,而在诱导后48h仅为0.06%。诱导后细胞不表达GFAP。Nissl染色结果表明,诱导后细胞胞质中含有Nissl体。本研究结果证明DMSO和BME联合诱导MSCs可获得具有神经元表型特征的MSCs源性神经细胞。