苯并（a）芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化的不同阶段特征

目的分析致癌物作用后至细胞转化过程中不同代次细胞的表达变化特征,为寻找出可能发生癌变的关键阶段、揭示致癌机制提供科学依据。方法采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B,分设B(a)P组和DMSO溶剂对照组,染毒时间24h后细胞常规培养,系统观察发生于转化过程中的细胞生物学特性并由血清抗性、锚着独立性生长能力,裸鼠成瘤试验来鉴定细胞的恶性转化情况,建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化不同代次的细胞模型。采用细胞遗传学方法分析了不同代次细胞的染色体改变;提取实验组和对照组不同代数细胞的mRNA,用Affymetrix公司U133plus2.0人类全基因组表达谱芯片分析获得差异表达基因,并对差异表达的基因进行筛选。结果实验组细胞在20代后细胞形态不规则的数量开始增多,核浆比例增大,出现病理性核分裂像。第10代时各组细胞血清抗性试验均为阴性;第20代实验组细胞出现血清抗性和倍增时间增长。25代时实验组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,细胞数十个左右聚集成团,但生长缓慢,不能进一步形成较大的克隆,达不到每个集落大于50个细胞的标准;至第30代时,实验组细胞即能在软琼脂上形成克隆。软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。中途死亡实验组裸鼠两只,常规病理切片检查,有异形上皮细胞聚集成团,已具备癌前转化的特征。从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。得到第1、5、10、20和30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱。发现不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征,且各代之间差异表达的基因也有很大差异,以1、5和30代细胞表达的差异基因为基准对差异基因进行了聚类分析,初步揭示了这些差异基因在不同代次细胞的表达模式和特征。结论从已知的与肿瘤相关的基因变化来看,尽管第5代已有肿瘤相关基因的变化,但以10、20代细胞的变化最明显,提示此阶段可能是癌变的关键阶段,而第10代可能是细胞癌变的早期阶段。     

DNMTs在长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用

目的检测经长期氡暴露而发生恶性转化的人永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)中甲基化转移酶(DNMT)基因的动态变化,从表观遗传学层面探索氡致肺癌的作用机制。方法应用流式细胞仪分析法,软琼脂集落形成及裸鼠成瘤实验鉴定长期氡暴露过程中BEAS-2B细胞的恶性转化程度,以QPCR方法检测DNMT1、DNMT3A的mRNA表达量。结果与对照组细胞相比,染氡30代传代至40代的细胞软琼脂克隆形成率已升高至27.27%±1.10%(P<0.05),转化细胞在裸鼠体内成瘤率达到30%(P<0.05),呈低分化癌;QPCR结果显示各染氡组传至40代细胞DNMT1 mRNA表达量均低于对照组,DNMT3A mRNA表达量均高于对照组。结论建立并确认了体外染氡诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型,且细胞恶性程度随染氡代数和传代代数的增加呈现剂量-效应关系,细胞出现移植成瘤。本试验条件下,DNMTs表达的改变导致细胞增殖失控,打破内环境平衡,这可能是在表观遗传学中,长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化的机制之一。     

不同粒径SiO_2颗粒诱导BEAS-2B细胞凋亡的研究

目的探讨不同粒径二氧化硅(silica particles,SiO_2)颗粒对支气管上皮细胞凋亡的诱导作用,进一步阐明SiO_2颗粒粒径相关的毒作用机制。方法以体外培养的支气管上皮细胞(Bronchial epithelial cells,BEAS-2B)为模型,随机分为对照组和SiO_2(Nano-Si40、Nano-Si60和Si200)颗粒暴露组,暴露浓度为6.25、12.5和25μg/ml。采用透射电子显微镜(TEM)观察3种SiO_2颗粒粒径、形貌特征及分散稳定性。细胞处理24 h后,采用MTT比色法测定细胞存活率;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法测定细胞膜的完整性;TEM观察SiO_2颗粒摄取;采用倒置荧光显微镜观察4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后细胞核的形态;Annexin V/PI双染标记后采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡的情况。结果电子显微镜结果显示3种SiO_2颗粒分布均匀,大小均一,颗粒呈圆形或椭球形,分散性良好,未发生明显聚集。Image J软件计算颗粒平均粒径分别为41.26±3.78、61.51±7.93和206.31±18.70 nm。与对照组相比,SiO_2颗粒作用BEAS-2B细胞24 h后,细胞存活率下降(P0.05);细胞培养液中LDH活力明显升高(P0.05);3种SiO_2颗粒均能够被BEAS-2B细胞摄取,大量的粒子以单个粒子或以膜包裹的聚集状态分布在胞质中,呈核周分布的现象;DAPI染色细胞核出现核固缩、核碎裂和染色质凝聚边缘化等典型的凋亡细胞核形态;3种SiO_2颗粒均能诱导细胞凋亡发生,且随着颗粒浓度的增加和粒径的减小,凋亡率逐渐升高。结论 SiO_2颗粒可被BEAS-2B细胞摄取,降低细胞存活率,进而破坏细胞膜完整性,最终诱导细胞凋亡发生,且具有明显的剂量和粒径依赖趋势。     

纳米二氧化硅对BEAS-2B细胞的毒性研究

目的 评价纳米二氧化硅颗粒物对人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性作用及可能机制。方法(1)扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察经100μg/ml的20 nm二氧化硅和结晶型二氧化硅(MinU-Sil 5)暴露24~72 h后的BEAS-2B细胞形态变化;(2)应用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)比色法检测实验组(纳米二氧化硅处理组)、阳性对照组(Min-U-Sil 5处理组)的细胞活力变化,分别测定不同实验条件下的还原型谷胱甘肽(GSH)、细胞内活性氧(ROS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;(3)流式细胞仪分析经暴露不同浓度20 nm二氧化硅后的细胞周期变化。结果 (1)经20 nm二氧化硅刺激24 h后BEAS-2B细胞体积增大,胞浆疏松,细胞数量减少,并随刺激时间延长而加重,阳性对照组上述变化不明显;(2)BEAS-2B细胞活力随暴露浓度和暴露时间的增加而下降,暴露浓度>50μg/ml时20 nm二氧化硅组的细胞活力下降与阳性对照组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),暴露浓度为100和200μg/ml时20 nm组与50 nm组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。100μg/ml浓度暴露24 h后,20 nm二氧化硅组细胞活力下降情况与阳性对照组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),暴露72 h后各组间细胞活力下降差异均有统计学意义(P<0.05)。BEAS-2B细胞培养基中的细胞内活性氧(ROS)升高、还原型谷胱甘肽(GSH)下降和乳酸脱氢酶(LDH)升高,并随暴露时间延长和二氧化硅粒径减小而变化;(3)纳米二氧化硅可使G2/M期停滞和G1期细胞增多,并呈现浓度效应。结论 纳米二氧化硅造成BEAS-2B细胞的细胞毒性作用强于结晶型二氧化硅(Min-U-Sil 5),纳米二氧化硅对BEAS-2B细胞的细胞毒性作用,具有浓度-效应、时间-效应和粒径-效应现象,细胞毒性作用并最终引起细胞氧化损伤。     

香烟烟雾处理对BEAS-2B细胞FHIT基因甲基化及其mRNA表达的影响

目的观察永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)经香烟烟雾长期处理后FHIT基因甲基化状况及其mRNA表达改变,探索吸烟致肺癌的机制。方法 BEAS-2B以20%烟雾浓度,每次10min作为染烟条件,细胞连续染烟2次作为染烟1代。细胞染烟30代且传代40代后,应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡和软琼脂克隆法检测克隆形成率判断其恶性转化程度,用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测FHIT基因甲基化状况,并通过Q-PCR检测FHIT的mRNA表达量。结果与对照组比较,各染烟组细胞出现了一定的S期阻滞,染烟后传代至40代细胞凋亡率较对照组下降明显(P0.05)。染烟20代传代至40代细胞(Sm20-40)与染烟30代传代至40代细胞(Sm30-40)FHIT基因启动子区呈高甲基化状态,且Q-PCR结果显示Sm20-40和Sm30-40组细胞FHIT基因mRNA均低于对照组(P0.05)。结论香烟烟雾可导致BEAS-2B细胞FHIT基因启动子区呈高甲基化状态,引起FHIT基因mRNA表达降低,可能是吸烟致肺癌的机制之一。     

干扰素-β对SiO_2诱导THP-1、A549和BEAS-2B细胞内细胞因子及纤维化基因变化的影响

目的探讨干扰素-β(INF-β)对SiO_2诱导THP-1、A549和BEAS-2B细胞内细胞因子及纤维化基因变化的影响。方法将二氧化硅(SiO_2)分别与无血清的THP-1、A549和BEAS-2B细胞温育4 h,之后用含有血清INF-β加SiO_2悬液培养上述3种细胞72 h后,采用荧光定量PCR方法测定对照组、SiO_2和INF-β+SiO_2组内细胞因子和纤维化相关基因IL-8(A)、TNF-β(B)、COLⅠ(C)和COLⅢ(D)的mRNA表达水平。结果 SiO_2作用上述3种细胞后,细胞因子和纤维化相关基因IL-8(A)、TNF-β(B)、COLⅠ(C)和COLⅢ(D)的mRNA表达水平与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05);经INF-β+SiO_2作用上述3种细胞后,细胞因子和纤维化相关基因IL-8(A)、TNF-β(B)、COLⅠ(C)和COLⅢ(D)的mRNA表达水平与SiO_2组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 SiO_2可提高THP-1、A549和BEAS-2B细胞因子IL-8及TNF-β基因mRNA表达水平,主要对THP-1细胞内IL-8 mRNA的诱导效果为最强,INF-β对于IL-8及TNF-β的基因mRNA表达具有降低作用,然而INF-β抑制COLⅠ及COLⅢ的基因mRNA表达,说明INF-β对SiO_2诱导人呼吸道细胞内纤维化相关基因表达具有抑制作用,可能与矽肺发病及防治机制具有一定关系。     

六价铬致BEAS-2B细胞DNA损伤修复基因转录组学特征分析

目的研究六价铬暴露对细胞DNA损伤修复相关基因的影响。方法将人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)暴露于0.20、0.60、1.80μmol/L六价铬24 h,提取RNA进行转录组学的测定。分析得到不同剂量组的差异表达mRNA并与AmiGO 2数据库进行比对,提取并分析DNA修复相关基因的差异表达、功能、互作网络及候选基因。结果六价铬染毒后共得到3 959个差异基因,其中下调基因共有2 928个,上调基因有1 031个。在不同染毒剂量下,低、中和高染毒组各有506、981以及2 472个差异基因。对提取的DNA修复相关基因分析的结果显示,SMC1A基因在3个剂量组中均差异表达;有11个基因在中、高剂量组中均差异表达,其中有3个基因参与DNA双链断裂的修复,分别为BRCA2、RAD51B和PRKDC,在高剂量组中与对照组差异表达的倍数分别为0.70(P=0.005)、0.19(P=0.003)和0.52(P=0.007);MGME1基因涉及线粒体DNA的修复,相对于对照组,中、高剂量组表达改变倍数为0.75(P0.001)、0.67(P=0.025)。结论六价铬染毒后DNA部分修复基因表达发生了改变,其中DNA双链断裂修复相关基因BRCA2、RAD51B和线粒体DNA修复基因MGME1可作为进一步研究的候选基因。     

镍化合物体外诱发细胞恶性转化的研究 Ⅱ 镍化合物诱导大鼠气管上皮细胞恶性转化

原代RTE细胞在3 T3滋养细胞支持下,在体外培养条件下可生长。在接受MNNG与多种镍化合物作用后,可出现恶性转化。镍化合物诱发恶性转化的能力强弱依次为Ni_3S_2、Nis(C)、NiS(A)、NiCl_2和NiSO_4,与动物诱癌试验结果一致。该系统可用于研究化学物质诱发呼吸道肿瘤的致癌过程,亦可用于定量检测化学致癌物。     

煤焦沥青提取物对BEAS-2B细胞Keap1-Nrf2/ARE通路的作用机制

目的研究煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2、Keap1、NQO1的基因及其蛋白表达的影响,以探讨煤焦沥青烟提取物在造成细胞氧化损伤过程中Nrf2-Keap1/ARE通路的作用机制。方法设立未处理对照组、0.1%DMSO溶剂对照组、5μg/ml B(a)P阳性对照组、6μmol/L全反式维甲酸组、6μmol/L全反式维甲酸预处理0.5 h后5μg/ml CTP染毒组和CTP染毒组(1、5、10和20μg/ml),染毒3、6、12和24 h后提取总RNA;RT-PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的相对表达量;Western blot测定Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的相对表达量。结果不同CTP染毒剂量作用后各个基因mRNA相对表达量差异无统计学意义(P0.05),而不同时间点相对表达量差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示,随着CTP烟提取物染毒浓度的增加,Keap1蛋白无明显变化,NQO1蛋白表达量逐渐上升;Nrf2蛋白在5μg/ml染毒浓度时表达最高,在5μg/ml CTP染毒浓度作用下,BEAS-2B细胞Nrf2蛋白表达量随时间逐渐升高,在染毒6 h后达到最高,之后表达量又呈下降趋势。结论煤焦沥青烟提取物作用于BEAS-2B细胞后,代谢酶NQO1表达上调,推测Keap1-Nrf2/ARE通路可能通过上调细胞保护性基因NQO1的表达而对抗煤焦沥青毒性作用,降低细胞氧化损伤。     

干扰素γ诱导肝癌HepG2细胞表达B7分子的实验研究

目的研究干扰素γ(IFN-γ)对人肝癌细胞B7分子表达的影响。方法选用人肝癌HepG2细胞进行体外培养,经过不同浓度的IFN-γ干预后,采用MTT法检测细胞增殖作用,RT-PCR检测B7-1和B7-2mRNA的表达。结果不同浓度的IFN-γ对HepG2细胞体外生长有明显抑制作用;干预后HepG2细胞的B7基因表达明显增加。结论IFN-γ能直接抑制HepG2细胞增殖,显著上调HepG2细胞B7基因的表达,具有一定的抗肿瘤效应。     

氰戊菊酯对细胞色素P450 2B1/2B2的诱导

１５只ＳＤ大鼠随机分为氰戊菊酯（Ｆｅｎ）组（１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１×７,ｉｇ）,苯巴比妥（ＰＢ）诱导组（８０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１×３,ｉｐ）及溶剂对照组（给予Ｆｅｎ组等体积的二甲亚砜,处理同Ｆｅｎ组）．应用不连续ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分离细胞色素Ｐ４５０,用ＣＯ差示光谱法和细胞色素Ｃ还原法测定Ｐ４５０含量及ＮＡＤＰＨ－细胞色素Ｐ４５０还原酶活性,用ＣＹＰ２Ｂ１／２Ｂ２抗体及ＣＹＰ３Ａ１／３Ａ２抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析,用免疫组化和半定量ＲＴ－ＰＣＲ等技术观察Ｆｅｎ影响大鼠脑,肝组织细胞色素Ｐ４５０亚型的特异性．结果显示,与溶剂对照组相比Ｆｅｎ可使脑和肝中Ｐ４５０含量及ＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０还原酶活性增高;Ｐ４５０２Ｂ１／２Ｂ２增加,Ｐ４５０３Ａ１／３Ａ２未见改变;Ｐ４５０２Ｂ１／２Ｂ２ｍＲＮＡ含量相应增加．由于正常大鼠脑,肝组织中Ｐ４５０２Ｂ１／２Ｂ２表达很低,Ｆｅｎ对该亚型Ｐ４５０的诱导可能会干扰机体对内,外源化合物的正常代谢,从而产生毒作用．     

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的细胞周期相关蛋白表达

目的　了解细胞周期调控系统各正、负调节因子在细胞发生恶性转化过程中的变化情况。方法　采用免疫组化技术分别检测了经环磷酰胺(CP)和塞替派 (TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)发生恶性转化的BEAS CP和BEAS TE细胞中P5 3、P16、P15、细胞周期蛋白 (cyclin)D1和RB蛋白的表达。结果　BEAS 2B细胞中表达阳性的P16、P15及RB蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中表达缺失 ;BEAS 2B细胞中检测呈阴性的P5 3蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中呈阳性 ;cyclinD1蛋白在 3株细胞中检测均为阳性。结论　转化细胞中P16、P15及RB蛋白的表达异常可能影响了细胞周期中P16 (P15 ) /cyclinD1 CDK4 /pRB调控途径的自稳平衡。两转化细胞P5 3蛋白的阳性表达提示转化细胞P5 3蛋白的功能已发生改变。     

没药甾酮对胆管癌 RBE 细胞移植瘤生长和 miRNA表达谱的影响

目的：研究没药甾酮对胆管癌RBE细胞株移植瘤生长和miRNA表达的影响。方法雌性SD大鼠建立胆管癌RBE细胞株移植瘤模型,随机分为对照组和没药甾酮高、低剂量实验组;高、低剂量实验组大鼠分别予40、20 mg· kg－1· d－1没药甾酮灌胃,对照组大鼠予生理盐水灌胃。每5天测量裸鼠质量和肿瘤体积,处理30 d后取材,提取肿瘤组织总RNA并分离miR-NA。采用微阵列杂交,通过芯片扫描和数据分析获得miRNAs表达谱。结果高、低剂量实验组大鼠移植瘤体积分别在处理20 d和25 d后显著低于对照组（P＜0．01）;处理30 d 后高、低剂量组移植瘤质量均显著低于对照组（P＜0．01）。芯片结果显示,高剂量实验组瘤组织miRNAs表达谱与对照组相比有显著差异。结论没药甾酮可以显著抑制胆管癌RBE细胞株移植瘤生长并影响其miRNA的表达。     

选择性诱导表达Bcl2的乳腺癌细胞凋亡

肿瘤细胞的基本特点之一就是逃避细胞凋亡。Bcl2家族既有抗凋亡蛋白也有促凋亡蛋白。由于抗凋亡Bcl2蛋白的高水平表达与许多恶性肿瘤相关,抑制Bcl2或有关抗凋亡蛋白已经成为诱导肿瘤细胞凋亡或提高这些细胞对化疗敏感性的一种策略。对Bcl2的结构分析便于确定一些小分子化合物,它们可以抑制促凋亡蛋白的BH3区域和Bcl2或Bcl XL上的疏水凹陷之间的相互作用。一些此类化合物确存在具有治疗应用价值的抗肿瘤作用。然而,以Bcl2为靶点的药物对正常细胞,如造血祖细胞和上皮细胞的作用并没有进行过检测。研究人员近期发现了一种新型Bcl2的小分子…     

宫颈癌细胞低氧条件下缺氧诱导因子表达变化

目的:探讨宫颈癌细胞在不同缺氧条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达变化。方法:Hela细胞在正常条件下(氧气浓度20 % )培养后,对照组在正常条件下继续培养96小时,试验组转入缺氧条件下培养96小时,氧气浓度分别为10% ,5% ,3% ,1 %。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HIF-1αmRNA表达变化,蛋白质免疫印迹法测定HIF-1α蛋白水平表达变化,生物化学方法进行培养液SOD、MDA含量测定。结果:正常对照组有一定水平的HIF-1αmRNA及蛋白表达,试验组HIF-1αmRNA水平、蛋白表达显著升高(t=2.471～5.474,P<0.01) ;其中3%氧气浓度组HIF -1αmRNA水平、蛋白含量最高。细胞培养液SOD含量随氧气浓度的降低逐渐降低(t=3.337～6.152,P<0.01) ,MDA含量逐渐升高(t=3.326～5.486,P<0.01)。结论:Hela细胞在缺氧条件下其HIF-1αmRNA及蛋白表达均升高,HIF-1α表达变化与缺氧条件下培养液中自由基的增加有一定关系     

反式BPDE诱导人支气管上皮细胞恶性转化

目的　探索苯并 (ａ)芘代谢物反式ＢＰＤＥ诱导人支气管上皮细胞 16ＨＢＥ转化的理想实验方案 ,构建恶性转化的细胞模型 ,为后期进一步研究其致癌分子机制提供理想的材料。方法　细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量 ,以不同剂量反式ＢＰＤＥ 1次或多次处理细胞 ,观察培养的不同阶段转化灶出现情况 ,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征 ,比较各组转化细胞的集落形成率。结果　以 0 1、0 5、1 0、2 0 μｍｏｌ Ｌ的剂量 ,对细胞多次间断染毒 ,传代 15次 ,是反式ＢＰＤＥ诱导 16ＨＢＥ细胞恶性转化的理想方案。其集落形…     

bcl-2在恶性淋巴瘤细胞中的表达及临床意义

目的:观察bcl-2在恶性淋巴瘤患者瘤细胞中的表达,并分析其与预后的关系。方法:SABC免疫组化法检测bcl-2在恶性淋巴瘤患者和非肿瘤患者细胞中的表达,分析二者之间的差别,并分析恶性淋巴瘤患者阳性表达和阴性表达间完全缓解率(CR)的差别。结果:bcl-2在恶性淋巴瘤患者肿瘤细胞中的表达明显高于非肿瘤对照者(P<0.05),bcl-2阳性表达的恶性淋巴瘤患者的完全缓解率与阴性表达者的差异无显著性(P>0.05)。结论:bcl-2的阳性表达可能是恶性淋巴瘤对药物不敏感的原因之一,可作为判断恶性淋巴瘤患者预后的指标之一,对判断恶性淋巴瘤患者的预后更有意义。