聚合酶链反应-单链构象多态性结合银染技术检测低密度脂蛋白受体基因点突变

家族性高胆固醇血症 (Familialhypercholesterolemia ,FH)是一种常染色体显性遗传病 ,是导致动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)和早发冠心病的重要危险因素 ,其发病机理主要为低密度脂蛋白受体 (Lowdensitylipoproteinreceptor,LDL R)基因突变引起LDL R功能异常。本研究应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)结合银染技术对一例临床诊断为FH的先证者的LDL R基因进行研究 ,以探讨其分子病理机制。一、材料和方法1.研究对象 :由我室门诊收集 ,先证者系女性 ,1992年出生 ,籍贯北京。先证者黄色瘤累及肘、膝、踝关节等处易受…     

银染单链构象多态性检测冠心病载脂蛋白E基因型

目的 ①建立一种简便、准确、实用的人栽脂蛋白E(apoE)基因型的检测方法；②研究冠心病(CHD)患者栽脂蛋白E基因多态性。方法 应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增apoE基因含编码112位和158位氨基酸的基因序列，用SS—SSCP技术进行apoE基因型分析。结果 运用SS—SSCP法检测了47名冠心痛患者apoE基因型，发现ε4／2、ε3／2、ε3／3、ε4／3、ε4／4基因频率分别为4．26％，14．89％，63．83％，12．76％，4．26％，并且发现ε2、ε3、ε4等位基因频率分别是9．57％，77．66％，12．77％。结论 ①该方法简单、快速、准确，对人体无害，适合于一般实验室开展；②ε4等位基因是CHD的易患因子之一，而ε3等位基因则具有保护作用。     

银染结合反转录PCR检测丙型肝炎病毒核酸

银染结合反转录ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒核酸郑文婕王升启孙志贤（军事医学科学院放射医学研究所，北京１００８５０）关键词银染色法反转录ＰＣＲ丙型肝炎病毒本文建立了银染技术结合反转录ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的方法，并以ＨＣＶ阴、阳性血清衡量了本方法的...     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的 探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法 设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应－单链橡象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果 以药敏试验结果对照,有１６株ＲＦＰ敏感株为２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性００％。对部     

OPRM1 A118G基因多态性与艾森克人格类型和疼痛敏感性相关性研究

目的 探讨OPRM1 A118G基因多态性与艾森克人格类型和疼痛敏感性的相关性。方法 选择2018年1月—2020年12月泸州市人民医院由急诊医学部转普外科住院的手术患者。术前采用艾森克人格问卷调查患者人格类型并使用电刺激仪测定痛阈和耐痛阈,利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术检测患者外周静脉血OPRM1 A118G基因型。根据分型结果将患者分为野生纯合子（A/A）组、突变杂合子（A/G）组、突变纯合子（G/G）组。分析3组患者的一般情况、疼痛敏感性、艾森克人格问卷评分、艾森克人格类型的差异性和艾森克人格类型与疼痛敏感性的相关性。结果 共纳入患者356例。其中,A/A组174例,A/G组136例,G/G组46例。OPRM1 A118G基因突变率为32.00%。3组患者的疼痛敏感性（痛阈、耐痛阈）及内外向、神经质、掩饰性人格类型评分比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。3组患者内外向和精神质型人格类型比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。不同内外向和精神质人格类型中的痛阈及耐痛阈比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 OPRM1 A118G基因...     

银染单链构象多态性技术检测原发性肝癌p53基因的突变

目的建立银染单链构象多态性技术检测原发性肝癌ｐ５３基因突变。方法用银染及单链构象多态性（ＳＳ－ＳＳＣＰ）技术检测１６９例原发性肝癌的癌变及癌旁正常组织ｐ５３基因第７，８外显子（Ｅ７，Ｅ８）的突变，并进行ＤＮＡ测序，鉴定突变位点。结果４例患者ｐ５３基因Ｅ７中第２４９号密码子第３号碱基发生了Ｇ：Ｃ→Ｔ：Ａ的颠换（ＡＧＧ→ＡＧＴ），２例患者Ｅ８中第２７３号密码子第１号碱基发生了Ｃ：Ｇ→Ｔ：Ａ的转换（ＣＧＴ→ＴＧＴ），总的突变率达３８％（６／１６）；６例ｐ５３基因突变的癌变组织中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的整合率为５／６，８例未发生ｐ５３基因突变的癌变组织中ＨＢＶ的整合率仅为１／８，两者相比差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论ｐ５３基因突变是原发性肝癌发生发展过程中的常发事件，且与ＨＢＶ的慢性感染密切相关。进一步研究有利于探讨原发性肝癌的发病机制，并为基因治疗提供依据。     

银染PCR—SSCP分析膀胱癌P^53基因突变

为探讨Ｐ＾５３基因突变与膀胱癌病理分级和临床分期的关系,应用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术分析４６例膀胱癌石蜡标本中Ｐ＾５３基因突部疗养院结果显示膀胱癌中Ｐ＾５３基因突变率为３０．４％,分化不良的Ⅲ级膀胱癌Ｐ５３基因突变率显著高于Ⅰ、Ⅱ级分化较好者。发生浸润和转移的Ｔ３－４期膀胱癌Ｐ＾５３基因突变率显著高于Ｔｉａ－Ｔ１期表浅性膀胱癌。提示：Ｐ＾５３基因突变是膀胱癌恶生程度的生物学标志之一,可用来评估患者     

南京地区汉族人群中人类血小板抗原基因多态性及分析

人类血小板抗原(Ｈｕｍａｎｐｌａｔｅｌｅｔａｎｔｉｇｅｎ,ＨＰＡ)分型对临床上一些因血小板同种免疫反应导致的同种免疫性疾病,如新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(ＮＡＩＴＰ),输血后紫癜(ＰＴＰ)及血小板输注无效(ＰＴＲ)等的诊断和治疗有重要意义[13]。长时期来,人们一直沿用传统的血清学方法进行ＨＰＡ分型,但由于难以获得高质量、特异性抗血清等多种因素的制约,ＨＰＡ分型工作始终无法深入下去。随着对ＨＰＡ基因研究的深入,近年来国外陆续报道将基因检测技术用于血小板分型研究中。本文应用聚合酶链序列特异性引物(ＰＣＲＳＳＰ)…     

非变性PAGE对DIS80位点扩增片断多态性分析

目的：为了解广西壮族人群DIS80位点群体遗传资料。方法：使用PCR结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染技术分析300名广西壮族无关个体DIS80位点多态性。结果：观察到23个等位基因，74个基因型，杂合度、非父排除率、个体识别及多态信息含量分别为0．824、0．763、0．968、0．875。其基因型频率分布符合Hardy-weinberg定律。对5个家系相关个体分析符合孟德尔定律。结论：该方法具有快速、简便、灵敏度高特点。     

PCR／RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究

为查明江苏地区恙虫病立克次体型别及目的基因序列差异性。本室构建Ｒｔ外膜主要蛋白型特异抗原５６ｋＤ的群、型引物进行ＰＣＲ分型。选用ＳｎａＢＩ，ＨｈａＩ和ＢｇｌⅡ限制性核苷酸内切酶切割ＰＣＲ产物方法，对江苏地区的５份Ｒｔ目的基因分析研究与标准参照株Ｒｔ比较。     

Tuberculosis diagnosed by PCR analysis of synovial fluid

Tuberculosis is a leading cause of mortality due to an infectious agent worldwide. It often affects multiple organs by hematogenous spread of Mycobacterium tuberculosis, but knee-joint involvement is extremely rare, comprising approximately 0.1% of all forms of tuberculosis. We present a case of tuberculous pleuritis with knee-joint involvement. Cytological and biochemical analysis of the pleural fluid and a biopsy specimen of the cervical lymph node indicated tuberculosis, but a definitive diagnosis was not given. A confirmed diagnosis was finally obtained through PCR analysis of the synovial fluid. Tuberculosis should be included in the differential diagnosis in patients with persistent pain and swelling of the knee. PCR analysis of the synovial fluid is a quick and useful method for the diagnosis.     

Identification of the ETT2 locus in human diarrheagenic Escherichia coli by multiplex PCR

An Escherichia coli type III secretion system 2 (ETT2) locus was discovered in enterohemorrhagic E. coli O157:H7. To determine presence or absence of the ETT2 locus in diarrheagenic E. coli, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) encoding Shiga toxins (stx₁ and stx₂), intimin (eaeA), and ETT2 (etrA) was developed for rapid detection. The ETT2 locus was identified not only in Shiga toxin-producing E. coli (STEC) but also in various non-STEC.     

实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α地中海贫血基因型的技术。方法运用SYBRGreen1和ABI7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应(SYBRQPCR),同时进行融解曲线(D.C)和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cutoff值定为PCR结果阳性。将PCR产物重组到T载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBRQPCR得出标准曲线。从而定量未知标本。结果优化了3个SYBRQPCR反应的引物及其浓度,热循环条件等。检测SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃。αα等位基因的PCR产物长206bp,Tm=83.0℃±1℃。非SEA等位基因的PCR产物长436bp,Tm=84.0℃±1℃。重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上。联合运用3个SYBRQPCR反应可以为SEA缺失携带者、缺失型HbH病、非缺失型HbH病、α地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断,并可用于产前诊断。结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低、易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。     

PCR定点诱变方法构建BCR—ABLcDNA竞争性PCR内参照物

本实验通过合成与原有下游引物（Ｂ）相似的一条新引物（Ｂ’）,经聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）扩增出比原ＢＣＲ－ＡＢＬｃＤＮＡ序列减少了４个碱基的参照物,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明,两型ＢＣＲ－ＡＢＬｍＲＮＡ均可通过此方法得到相应的ｃＤＮＡ参照物。参照物和特测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离,证明了其可行性。该参数物可用于慢性粒细胞白血     

Detection of Leishmania infantum in 4 different dog samples by real-time PCR and ITS-1 nested PCR

The canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis is an important step of visceral leishmaniasis control program in Brazil, which involves the elimination of infected dogs, the main animal reservoir host of the disease. The aim of the present study was to evaluate a sensitive real-time PCR method for Leishmania infantum detection in 4 different clinical samples of dogs, including the noninvasive conjunctival swab (CS) sample. The results of real-time PCR were compared with those obtained using internal transcribed spacer 1 nested PCR. Animals were divided into 2 groups based on the absence or presence of CVL clinical sings. The CS associated with real-time PCR, using primers addressed to kinetoplast DNA minicircles, was able to detect L. infantum infection in 96.7% of dogs without clinical signs and in 100% of the symptomatic animals, demonstrating the importance of these procedures for diagnosing CVL.     

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。     

荧光定量聚合酶链反应技术检测儿童患者人巨细胞病毒结果分析

目的 了解本院儿童患者人巨细胞病毒(HCMV)感染现状.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对243例住院疑似患儿进行HCMV-DNA定量检测.结果 HCMV总阳性率为16.05%;男性和女性阳性率分别为17.83%和12.79%;1个月至1岁年龄组(婴儿期)患者最高为17.41%.临床诊断主要以肝损害、腹泻和黄疸为主.结论 加强儿童患者HCMV的检测,有助于临床诊断与治疗方案的选择.     

HLA—DQB1基因分型技术

报告了简便、快速的ＨＬＡ－ＤＱＢ１聚合酶链反应一序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）基因分型技术。比较了基因分型与血清学分型技术的结果，其中３３份标本中６份血清型结果（１８．２％）与基因型不吻合。还讨论了基因分型的意义