利用甲基营养型酵母表达外源基因

甲基营养型酵母是一种新型外源基因表达系统,它兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工,其发酵条件简单,表达水平高,适宜高密度培养,并且具有分泌型表达的优势,为工业化生产和纯化提供极大的方便.它作为一个具有广阔前景的系统正日益受到人们的重视.     

利用甲基营养型酵母表达外源基因

甲基营养型酵母是一种新型外源基因表达系统，它兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工，其发酵条件简单，表达水平高，适宜高密度培养，并且具有分泌型表达的优势，为工业化生产和纯化提供极大的方便。     

巴斯德毕赤酵母真核蛋白表达系统的研究进展

自 1 98 1年 hitzeman等 [1 ] 首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后 ,相继又有多种外源基因表达成功。但是常规的酿酒酵母表达系统由于发酵密度不高 ,蛋白分泌能力较差 ,糖基化修饰过度可能会引起副反应等 ,近年来已被新的酵母宿主细胞所取代 ,如巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维亚酵母、粟酒裂殖糖酵母、烷烃利用型耶鲁酵母、西方许旺氏酵母和多形汉逊酵母等 ,合称非常规酵母表达系统。它们往往具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、温度适应范围广 (2 5℃～ 4 6℃ )、蛋白质分泌能力强等特点 ,正好补充了酿酒酵母的不足。其中的巴斯德…     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统，由于其有许多突出的优点，越来越受到分子生物学界的重视，已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述，并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

酵母表达系统：高产量的重组蛋白

有许多不同的酵母已经有效地被利用来分析或表达真核蛋白。酵母的优点是生长快速，发酵条件可轻易批量化，设备相对简单．各项遗传和生物特性都被充分了解，更重要的是可以像哺乳动物细胞一样做转译后的修饰．所以非常适合于真核重组蛋白的大量生产。     

大肠杆菌表达系统的研究进展

近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。     

基因工程抗体表达系统研究进展

为使临床上能广泛应用基因工程抗体，当务之急是研究方便、快捷、经济和批量制备活性抗体的技术，关键是选择高表达系统。本文对大肠杆菌、酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞表达系统进行了比较，并介绍其研究进展。     

基因工程抗体表达系统研究进展

本文对大肠杆菌，酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞表达系统进行了比较，并介绍其研究进展。     

戊型肝炎病毒（HEV）开读框架2（ORF2）1．3kb基因片段在甲基营养型酵母（Pi

戊型肝炎病毒（HEV）整个基因组有3个开放性阅读框架（ORFs)，ORF2是主要结构基因编码区，将戊型肝炎病毒（HEV）ORF21．3kb基因定向亚克隆到甲基营养型酵母－巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris)分泌性表达质粒pHIL-S1和pPIC9中，转化入大肠杆菌，筛选出阳性重组株，重组质粒pPIC9HEV和pHILS1HEV分别经限制性内切酶Sal I和Bg1 II线化，电转化入巴斯德毕赤酵母GS115。与宿主GS115染色体发生整合，整合方式不同，产生两种表型，分别为HIS＋MUT＋）甲醇诱导快的，HIS＋MUTS（甲醇诱导慢的），通过营养缺陷性选择性培养基筛选出阳性菌株，经PCR技术确认外源基因整合在酵母染色体中，重组菌株先在甘油培养基中充分增殖，然后转移到甲醇培养基中诱导，取上清液，用ELIAA，SDS－PAGE，Western-blot检测到特异性HEVORF2蛋白，得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株。     

巴斯德毕赤酵母启动子研究进展

目前,巴斯德毕赤酵母表达系统是非常成功的外源蛋白表达系统之一,其启动子的开发和利用也备受关注.醇氧化酶1启动子(alcohol oxidase 1 promoter,PAOX1)在巴斯德毕赤酵母中应用最为广泛.鉴于外源蛋白表达的需要,不断有启动子被发现和利用,如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,PGAP)、甲醛脱氢酶1启动子(formaldehyde dehydrogenase 1 promoter,PFLD1)等.此文列举了多种巴斯德毕赤酵母启动子,并对启动子的来源、特点以及外源蛋白的表达等方面进行综述,以期为启动子的选择提供参考.     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

木瓜凝乳酶基因克隆及毕赤酵母分泌型重组表达载体构建

目的扩增木瓜凝乳酶基因 ,构建重组表达载体。方法提取木瓜组织RNA ,采用RT PCR方法扩增木瓜凝乳酶基因 ,测序并利用BLAST软件进行序列分析。利用基因重组方法构建重组表达载体。结果扩增得到木瓜凝乳酶基因。结论构建了可在毕赤酵母表达系统中表达天然木瓜凝乳酶蛋白的重组表达载体。     

戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

糖蛋白药物糖基化及其表达系统的研究进展

大约有四分之一的新药是蛋白类药物,其中糖蛋白药物占了绝大部分。本文从药物代谢动力学、组织靶向和调节生物活性等三个方面综述了糖基化对最佳治疗效果的影响,并且评估了CHO和酵母表达系统以求达到最佳糖基化。哺乳动物细胞培养是现今糖蛋白的生产系统,它存在以下几个缺点：成本高,周期长,糖基化作用受限。鉴于此,现在也已经开发了酵母表达系统来替代哺乳动物细胞培养,它具有表达能力高,发酵易于控制,可以进行氮糖基化的优点,尤其是P．pastoris工程酵母必将有更加广阔的应用前景。     

气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统,为基因表达系统使用得最多、最广泛。与以往的基因表达系统相比,它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。在以甲醇为诱导物的酵母表达系统中,对于甲醇含量的多少对酵母表达量有着决定性的作用。甲醇含量低表达量就小,反之,表达量过高会使酵母中毒,导致倒罐的情形。通常情况下很难以pH和DO来判断甲醇含量的是否过量或不足,如果能确切并实时地知道酵母表达系统中甲醇的含量,对于提高外源蛋白表达量起重要的作用。     

HBsAg基因在酵母中的表达

将 HBV 基因组在大肠杆菌中克隆和增殖,这一成就使人们对于 HBV 基因组的结构和功能有了新的认识,因而希望克隆的HBsAg 基因在大肠杆菌中表达,以产生 HBV疫苗。然而,尽管作了许多努力,由于在大肠杆菌中,HBsAg 基因产物似不稳定,或者可对宿主引起有害作用,因而用大肠杆菌生产HBV 疫菌未获成功。