ERR1与核受体辅活化子相互作用位点研究

目的分析ERR1与核受体辅活化子相互作用的位点.方法用常规PCR方法和重叠延伸PCR构建ERR1的各种突变体到表达质粒pGBT9上,通过酵母双杂交实验分析其与已知核受体辅活化子PNRC的相互作用.结果成功构建了ERR1的缺失突变体pGBT9/ERR1 1-412、pGBT9/ERR1 1-144、pGBT9/ERR1 190-412 、pGBT9/ERR1 145-423、 pGBT9/ERR1 190-423、 pGBT9/ERR1 190-423 F232A、 pGBT9/ERR1 190-423 K244A.酵母双杂交实验显示ERR1的氨基酸145-423和190-423 可分别与PNRC相互作用;ERR1 190-423 K244A与PNRC的相互作用明显低于ERR1 190-423;其它突变体与PNRC的相互作用未检测到.结论 ERR1与核受体辅活化子相互作用的位点位于ERR1的配体结合结构域(LBD,aa190-423),ERR1与核受体辅活化子相互作用依赖于其LBD的AF2结构域,AF2结构域外的其它氨基酸F232、K244也对ERR1与核受体辅活化子相互作用起关键作用.     

hERR1/HBD酵母表达质粒的构建及初步鉴定

目的：构建酵母双杂合系统诱铒蛋白表达质粒pGBT9-hERR1/HBD。方法：PCR扩增hERR1/HBD（激素激活域）cDNA，与酵母Gal4/DBD(DNA结合域）表达质粒pGBT9重组构建融合蛋白表达质粒，酶切、测序鉴定后，用于酵母双杂合分析，检查其自主转录激活作用及与已知hERR1辅活化子PNRC的相互作用。结果：该质粒有正确的阅读框，其表达蛋白不具有自主转录激活作用，与已知核受体辅活化子PNRC有明显的相互作用。结论：成功构建了表达质粒pGBT9-hERR1/HBD，并证实该质粒可作为酵母双杂合系统的诱铒蛋白质粒，用于乳腺组织中与hERR1有相互作用的蛋白质基因的筛选。     

核受体及核受体辅活化子对芳香族化酶基因转录调控的研究

目的：研究核受体及核受体辅活化子芳香族化酶基因转录的调控,方法：酵母单,双杂合筛选,蛋白质－蛋白质相互作用分析,DNA突变,报告基因转染功能分析,迁移率改变及足迹分析等技术。结果：（1）鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子1,3和启动子Ⅱ的确切位置以及对这两个启动子起调节作用的沉默子（Siklencer)S1和cAMP效应要素（CRFaro)等顺式作用元件。（2）分离鉴定了能与类固醇衍生因子1（Sterodogenic Factorl,SF1)相互作用并参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子,其中近50％的克隆编码两种新的富含脯0氨酸的核受体辅调节蛋白质,命名为PNRC（Proline-rich Nuclear Receptor Coactivators)。功能分析显示PNRC通过与SF1或ERR1相互作用,进一步增强SF1或ERR1对芳香族化酶基因启动子1,3的转录激活作用。（3）缺失突变及定点突变分析证明含SH3结合模体的23个氨基酸残基区域是PNRC分子与核受体的相互作用位点。结论：我们鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子及调控序列,克隆了与DNA调控序列结合的蛋白质和通过蛋白质相互作用参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子－一种新型的核受体辅活化子PNRC。     

利用酵母双杂合系统筛选与hERRα1相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂合系统筛选乳腺组织中与人雌激素受体相关受体α1(Human estrogen receptor relatedreceptorα1，hERRα1)相互作用的蛋白质，特别是新的核受体辅助活化因子，以进一步研究核受体辅助活化因子在乳腺癌发生、发展中如何参与ERRl调控基因的表达。方法 以质粒pGBT9-hERrα1／LBD为“诱饵”，筛选人乳腺组织cDNA文库。结果 筛得有阳性相互作用的克隆共17个。除3种为已知核受体辅助调节因子外，其他为功能已经明确的蛋白，其中有3种与hERRα1有明显相互作用。结论核受体辅助活化因子SRc-1，RIP140，TRIP及数种已知蛋白能与孤儿核受体hERRα1在乳腺组织中相互作用。     

辅调节因子NRIF3受体特异性之机理的研究

目的:研究新发现的核激素受体辅调节因子(coregulator) NRIF3 的受体特异性的分子机理。方法:酵母双杂合体转化分析,选择典型菌株作β 半乳糖苷酶定量分析。结果:我们的结果提示一个双区结合模型,即单个NRIF3分子同时利用C端的LXXIL(受体结合功能区,即 RID1)和 N端的 LXXLL(RID2)与 TR或 RXR作用,RID1和RID2之间的距离对受体和NRIF3相互作用的亲和力有重要影响。结论:辅调节因子 NRIF3 受体特异性与其结构有关。     

ShcD通过PTB和SH2结构域和TrkC受体相互作用

目的 探讨ShcD与TrkC的相互作用,以深入认识TrkC下游信号转导的分子机制.方法 利用酵母双杂交技术,将TrkC及TrkC各种突变体的胞内区分别克隆到酵母质粒pAS2-1中,将ShcD及ShcD的4个结构域(CH2、PTB、CH1和SH2结构域)分别克隆到酵母质粒pACT2中,将它们分别共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测它们之间的相互作用.将TrkC克隆进pmRFP载体(带红色荧光蛋白),ShcD克隆进pEGFP载体(带绿色荧光蛋白),并将pmRFP-TrkC和pEGFP-ShcD共转染至293T细胞中,采用荧光共聚焦显微镜观察其定位情况.结果 ShcD可以和TrkC但不能和激酶失活突变体TrkCM1(K572A)结合;PTB和SH2结构域均可以与TrkC受体结合并且PTB结构域结合于TrkC的 NPQY模体;ShcD和TrkC在293T细胞中共同定位于胞膜和胞浆中.结论 ShcD通过PTB和SH2结构域以依赖于受体激酶活性的方式结合TrkC.     

ERβ相互作用蛋白HPIP的分离及其在ERβ信号途径中的作用

目的以雌激素受体β(ERβ)AF2结构域为诱饵,采用酵母双杂交方法,从人类乳腺cDNA文库筛选的蛋白HPIP,进一步验证其与ERβ相互作用的功能。方法分别用细胞免疫荧光分析和酵母双杂交的方法筛选蛋白的细胞内定位及结合结构域的鉴定,转染293T胚胎肾细胞,利用荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定,检测HPIP对ER转录活性的影响。结果 HPIP的编码基因主要分布于细胞质中,HPIP与ERβAF2结构域相互作用,而不与ERβAF1和DBD相互作用,HPIP能降低ER的转录活性,而且这种抑制作用在激素存在时更显著,但是雌激素受体抑制剂存在时,HPIP反而增强ERβ的转录活性。结论 HPIP可能通过影响ERβ信号途径在乳腺癌发生、发展中起重要作用。     

乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的 研究乳腺癌细胞中富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)基因启动子CpG岛的甲基化状态及在PNRC转录调节中的作用.方法 应用PT-PCR检测PNRC基因在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,并运用"MethPrimer"软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况;PT-PCR及Northern杂交检测乳腺癌细胞经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)作用后,PNRC基因mRNA的表达情况;Westernblot检测5-Aza-dc干预对PNRC蛋白表达的影响;将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,再经5-Aza-dc处理后,检测PNRC基因启动子的活性.结果 PNRC基因在乳腺癌细胞中的表达较正常乳腺细胞明显降低;乳腺癌细胞PNRC基因启动子区存在CpG岛甲基化;乳腺癌细胞经5-Aza-dc处理后,PNRC基因mRNA及蛋白表达水平显著增加,其PNRC基因启动子的活性也明显增强.结论 PNRC基因启动子区的高甲基化导致PNRC在乳腺癌细胞中表达降低.     

PGC-1α与能量平衡及糖、脂代谢的关系

PGC-lα即PPARGC-1(PPAR gammacoa ctivator-1)，属于PGC-1(PPARγ的辅激活因子)家族。Puigserver等从小鼠棕色脂肪组织(BAT)cDNA文库中克隆出PGC-1，其与结合于DNA的核受体相互作用，调节基因的表达。     

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.     

雄激素受体与核受体辅助抑制因子的关系

目的：探讨雄激素受体（AR）与核受体辅助抑制因子（SMRT）是否能相互作用及其作用部位。方法：重组构建AR,SMRT基因或其基因片段的质粒,体外转录,合成35S标记融合蛋白,采用转染试验及哺乳动物细胞双杂交实验（transient transfection, mammalian two-hybrid test）, GST沉淀试验（GST pull-down assay）,间接免疫荧光观察（indirect immunofluorescence staining）的方法,观察AR与SMRT的关系。结果：AR具有内在的转录抑制活性,可与SMRT直接作用,其作用部位：在AR分子上位于配体结合区（LBD）,而DNA结合区能增强这种作用;在SMRT分子上则位于羧基端核受体作用区（IDs）,在这个区域的LXXXIXXXI/L功能基团突变后将会影响AR与SMRT的结合。结论：AR通过其LBD区与SMRT分子中的ID2相互作用。     

健康献血员作为正常对照可靠性的研究

为了解健康献血员作为正常对照的可靠性，本文比较了33名健康献血员和36名健康志愿者血清中γ－谷氨酰转肽酶、IgA、IgG、IgM，可溶性白细胞介素2受体的含量，两组间各项指标差别无显著性．但献血累计次数超过6次者，IgG水平高于健康志愿者（P＜0．05），余项差别无显著性．从而认为，若献血员每3个月献血1次，每次300ml，累计小于6次者，可作为一般性酶学、免疫学定量实验研究的正常对照。     

大蒜素对肺癌A549细胞株β防御素表达的影响

目的β防御素(hum an beta defensins,HBD)是人体产生的天然抗菌物质,本研究通过大蒜素对β防御素表达的影响,探讨大蒜素的免疫调节机制。方法采用含大蒜素的细胞培养液处理人肺癌A549细胞,观察其对A549细胞不同种类β防御素mRNA表达水平的影响。结果含5μg/mL的大蒜素细胞培养液可使HBD3 mRNA的表达上调,而对HBD2和HBD1的表达无显著影响。结论大蒜素可以使A549细胞HBD3的表达升高,这可能是大蒜素参与人体免疫调节,提高机体免疫力的机制之一。大蒜素处理后HBD3升高而HBD2水平,不变进一步证实了HBD3与HBD2的诱导表达途径不同。     

多普勒超声对正常人二尖瓣口及肺静脉血流频谱的分析

目的利用多普勒超声观察正常人二尖瓣口及肺静脉血流频谱的变化,旨在探讨其影响因素及其间的相互关系.方法108例正常的健康人,平均年龄43 1±15.7岁.脉冲多普勒记录二尖瓣口血流频谱(MIF)及肺静脉血流频谱(PVF)参数.结果(1)MIF参数A、Ai、AF随年龄增长而升高,E、Ei、E/A随年龄增长而降低;PVF参数S、Si、S/D及SF随年龄增长而升高,D、Di随年龄的增长而降低.(2)在一定心率范围内,随着心率加快,MIF参数EI与PVF参数DI降低,SF增高.(3)MIF参数E、Ei、E/A、AF、APVF参数D、Di、S/D、SF、AR均有较好的相关性.结论正常人MIF和PVF的多普勒超声表现会受年龄、心率等些因素的影响,但其相互之间有着本质的联系.     

心房颤动患者血浆骨保护素、核因子κB受体活化因子配体水平及临床意义

目的探讨心房颤动患者血浆骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator ofnuclear factor kappa B ligand,RANKL)水平及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测40例阵发性房颤、39例持续性房颤、43例永久性房颤患者及40例窦性心律对照者血浆中OPG、RANKL水平。结果阵发性房颤组、持续性房颤组、永久性房颤组患者血浆中OPG、RANKL水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),持续性房颤组、永久性房颤组患者与阵发性房颤组相比血浆中OPG、RANKL水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而持续性房颤组、永久性房颤组患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 OPG、RANKL与房颤的发生和持续可能相关。     

慢性心房颤动患者心房肌钙转运调控蛋白基因转录表达的改变

目的探讨心房颤动(AF)时心房肌细胞钙超载的原因及其在AF发生和维持中的作用。方法采集风湿性心脏瓣膜病窦性心律患者12例(对照组)和AF患者14例(AF组)的右心耳组织,采用RT-PCR方法检测心房肌钙转运调控蛋白mRNA表达水平,测量AF患者左右心房内径、二尖瓣口面积和肺动脉收缩压。结果与对照组相比,AF组患者L-型电压依赖钙通道a1c亚基(LVDCCa1c)、肌浆网Ca2 -ATP酶和兰尼碱受体(RYR2)的mRNA表达水平显著下调(P均<0.01),三磷酸肌醇受体(IP3R1)的mRNA表达水平上调(P<0.05),而磷酸受纳蛋白和肌集钙蛋白的mRNA表达水平无明显改变(P均>0.05)。AF组患者肌浆网Ca2 -ATP酶的mRNA表达水平与左心房内径呈负相关(r=-0.573,P=0.032),与二尖瓣口面积呈正相关(r=0.625,P=0.017);LVDCCa1c的mRNA表达水平与二尖瓣口面积呈正相关(r=0.719,P=0.004)。结论细胞内钙超载机制可能参与了AF的发生和维持,心房肌钙转运调控蛋白mRNA表达异常可能是钙超载的分子生物学机制,钙转运调控蛋白mRNA表达异常与左心房解剖学改变之间存在内在联系。     

防御素2在肝内胆管结石病中的抗菌作用

目的探讨人防御素2(HBD2)在肝胆管结石病中的抗菌作用。方法应用免疫组织化学方法和RT-PCR检测肝内胆管结石患者手术切除肝组织标本HBD2的表达情况。比较胆汁培养为革兰阴性及阳性菌组的HBD2表达的强弱,左右肝组织HBD2表达的强弱,分析HBD2表达与急性生理功能和慢性健康状况评分系统(ARACHEⅡ)评分的关系。结果 HBD2在部分肝内胆管结石的胆管间质细胞胞浆中表达,革兰阴性菌组的肝组织HBD2表达强于革兰阳性菌组,左肝部位HBD2的表达强于右肝部位,ARACHEⅡ高分组的HBD2表达强于低分组。结论 HBD2在肝胆管结石病肝组织中起到抗菌作用,其表达强度与革兰阴性菌和ARACHEⅡ评分正相关。