冬凌草甲素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1的作用研究

目的探讨冬凌草甲素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1的抗白血病效应及其作用机制。方法以急性单核细胞白血病细胞株THP-1为研究对象,应用改良四甲基偶氮唑盐法测定4、6、8μmol/L浓度冬凌草甲素处理72 h后THP-1细胞的增殖抑制率,以及计算2、4、6、8、10μmol/L冬凌草甲素处理24、72、120 h后的细胞生存率并绘制生长曲线;显微镜下观察4、6、8μmol/L冬凌草甲素处理24 h后THP-1细胞的形态学变化;采用流式细胞术检测0、4、6、8μmol/L冬凌草甲素处理24 h后THP-1细胞凋亡率;采用Western blot法检测6μmol/L冬凌草甲素处理THP-1细胞0、12、24 h后Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK细胞信号转导通路的变化,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果 14、6、8μmol/L冬凌草甲素处理72 h后细胞增殖抑制率分别为(20.02±11.15)%、(45.99±12.76)%、(86.39±9.18)%,与4μmol/L冬凌草甲素比较,6、8μmol/L冬凌草甲素处理后细胞增殖抑制率均升高,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);冬凌草甲素处理72 h后细胞半抑制浓度为(6.12±1.48)μmol/L;细胞生长曲线显示,冬凌草甲素对THP-1细胞的生长抑制作用呈时间和浓度依赖性。2冬凌草甲素处理24 h后,THP-1细胞出现凋亡,形成凋亡小体,浓度越高细胞凋亡小体形成越多。30、4、6、8μmol/L冬凌草甲素(分别设为对照组及4、6、8μmol/L组)处理24 h后,THP-1细胞凋亡率分别为(3.7±1.1)%、(16.2±3.3)%、(30.1±4.3)%、(49.5±6.7)%,对照组与各浓度组凋亡率比较差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);与4μmol/L组比较,6、8μmol/L组凋亡率均升高,差异均有统计学意义(P0.05)。4经Western blot法检测6μmol/L冬凌草甲素处理THP-1细胞24 h后可抑制细胞内Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK信号转导通路的活化,并下调Bcl-2、上调Bax的表达。结论冬凌草甲素通过抑制Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK信号转导通路的活化,以及调节凋亡调节蛋白Bax和Bcl-2的表达而发挥抗白血病效应。     

冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡实验研究

目的 探究冬凌草甲素对多发性骨髓瘤(MM)U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过细胞培养和处理方法,采用0、10、20、30、40、50μmol/L的冬凌草甲素处理MM相关U266细胞、RPMI8226细胞48 h。采用MTT法测定U266细胞、RPMI8226细胞的增殖情况,采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒检测U266细胞、RPMI8226细胞凋亡情况,并采用蛋白质印迹法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的增加,U266细胞、RPMI8226细胞的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的升高,促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 冬凌草甲素具有抑制MM细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜力,其作用机制可能与促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,改变细胞Bcl-2/Bax比例,调节细胞凋亡有关。     

冬凌草甲素干预SHH信号通路抑制人结肠癌细胞SW1116增殖的实验探讨

目的研究冬凌草甲素对结肠癌细胞SW1116增殖的影响及机制。方法用不同浓度的冬凌草甲素处理SW1116细胞,MTT测定细胞增殖情况,计算其半数抑制浓度。SW1116细胞分为对照组、冬凌草甲素组、Cyclopamine组、联合组,对照组细胞培养液中不添加任何药物,冬凌草甲素组细胞培养液中添加70μmol/L的冬凌草甲素,Cyclopamine组细胞培养液中添加10μmol/L的SHH信号通路抑制剂Cyclopamine,联合组细胞培养液中添加10μmol/L的SHH信号通路抑制剂Cyclopamine和70μmol/L的冬凌草甲素,MTT检测细胞增殖,细胞克隆实验检测克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中音猬因子(SHH)、平滑蛋白(Smo)、锌指转录因子1(Gli-1)、剪切的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白水平。结果冬凌草甲素处理后的SW1116细胞增殖能力明显降低,其半数抑制浓度为(69.65±6.32)μmol/L。冬凌草甲素处理后的SW1116细胞增殖、克隆形成能力明显降低,细胞凋亡率明显升高,细胞中SHH、Smo、Gli-1蛋白表达水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,与未用冬凌草甲素处理的细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。SHH信号通路抑制剂处理也可以抑制SW1116细胞增殖和克隆形成,诱导SW1116细胞凋亡,促进细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达,减少细胞中Bcl-2蛋白表达。联合组的SW1116细胞增殖能力和克隆形成能力下降更多,细胞凋亡增加更多,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平更高,Bcl-2蛋白水平更低,与单纯冬凌草甲素处理的SW1116细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论冬凌草甲素通过抑制SHH信号通路抑制结肠癌细胞增殖和克隆能力。     

冬凌草甲素抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制研究

目的探讨冬凌草甲素抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制。方法采用不同浓度冬凌草甲素或相同浓度冬凌草甲素在不同时间处理SGC7901胃癌细胞株,通过MTT法检测其增殖水平。冬凌草甲素、西妥昔单抗、冬凌草甲素联合西妥昔单抗与SGC7901胃癌细胞株共培养后,采用流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化,Western blot检测细胞中表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)磷酸化表达水平,Real-time PCR检测Bcl-xL、Cyclin D1的转录水平。结果冬凌草甲素对SGC7901胃癌细胞株的增殖作用呈浓度及时间依赖性,浓度越高则增殖水平越低,相同浓度冬凌草甲素对细胞的增殖抑制作用随时间延长而增强,差异有统计学意义(P 0. 05)。流式细胞技术检测细胞凋亡结果显示,SGC7901胃癌细胞株无药物干预时凋亡率为(2. 90±0. 90)%;西妥昔单抗作用细胞后,细胞凋亡率为(9. 30±2. 20)%;冬凌草甲素作用后细胞凋亡率为(18. 20±4. 20)%;冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理组细胞凋亡率高达(57. 10±8. 70)%,显著高于单药组细胞凋亡率(P 0. 05)。冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理SGC7901胃癌细胞后,磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p ERK)、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3(p STAT3)表达水平减少,与冬凌草甲素组、西妥昔单抗组比较有显著差异(P 0. 05),Bcl-xL、Cyclin D1 mRNA转录减少,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论冬凌草甲素通过抑制EGFR/STAT3通路来抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性。     

冬凌草甲素通过TPX2诱导前列腺癌细胞凋亡与周期阻滞的研究

目的研究冬凌草甲素对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响及机制。方法用0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L冬凌草甲素处理前列腺癌LNCa P细胞,CCK-8法检测细胞增殖,q RT-PCR和Western blot检测细胞中Xklp2靶蛋白(TPX2)表达变化。前列腺癌LNCa P细胞分成对照组(NC)、Oridonin、TPX2 si RNA、TPX2 si RNA+Oridonin共4组。NC、Oridonin为转染阴性对照慢病毒载体的LNCa P细胞,TPX2 si RNA、TPX2 si RNA+Oridonin为转染TPX2 si RNA重组慢病毒载体的LNCa P细胞,Oridonin、TPX2 si RNA+Oridonin细胞用含有70 mg/L冬凌草甲素细胞培养液培养。在LNCa P细胞中转染TPX2 si RNA慢病毒载体,q RT-PCR和Western blot检测干扰效果。用冬凌草甲素处理下调TPX2的LNCa P细胞,CCK-8法检测细胞增殖变化,PI单染法检测细胞周期分布变化,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中细胞周期蛋白(cyclin B)、P21、活化的Caspase-3(C-Caspase-3)蛋白水平。结果冬凌草甲素处理后的LNCa P细胞增殖能力降低,细胞中TPX2 m RNA和蛋白表达水平降低。下调TPX2、冬凌草甲素和下调TPX2联合冬凌草甲素处理均可以降低LNCa P细胞增殖能力,提高细胞G2/M期比率,提高细胞凋亡率,促进细胞中cyclin B、P21、C-Caspase-3蛋白表达,并且下调TPX2联合冬凌草甲素对细胞增殖抑制、细胞周期阻滞、凋亡促进和cyclin B、P21、C-Caspase-3蛋白表达促进作用增强。结论冬凌草甲素可以通过下调TPX2表达诱导前列腺癌细胞凋亡并阻滞细胞周期。     

雷公藤甲素诱导急性髓细胞白血病干细胞凋亡及其机制

目的探讨雷公藤甲素诱导急性髓细胞白血病干细胞凋亡的分子机制。方法采用MTT法检测雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用,计算出IC50值,按照浓度梯度用雷公藤甲素处理KG-1细胞48 h,流式细胞仪检测细胞凋亡变化。Western blot法检测Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT等蛋白的变化。结果雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制呈剂量依赖性,IC50值约为4 nmmol/L,其还可诱导KG-1细胞凋亡。雷公藤甲素能够下调Bcl-2、β-catenin,p-AKT等蛋白的表达水平。结论雷公藤甲素诱导KG-1细胞的分子机制可能与Bcl-2、β-catenin、p-AKT的下调有关。     

二甲双胍诱导人胎盘绒毛癌细胞系JAR凋亡的机制初探

目的探索二甲双胍诱导人胎盘绒毛癌细胞系JAR凋亡的作用机制。方法将JAR细胞分为对照组和二甲双胍处理组(终浓度5、10、20、40、80mmol/L)处理24h后选取合适的药物浓度。激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫蛋白印记(Western blot)检测凋亡相关基因AMPK,p-AMPK,mTOR,Caspase-3,Bcl-2和Bax的变化趋势。结果 40mmol/L的二甲双胍处理能够引发JAR细胞凋亡,并且激活AMPK的磷酸化并下调mTOR的蛋白水平;同时上调Caspase-3和Bax的mRNA及蛋白水平,并且下调Bcl-2的mRNA和蛋白表达,降低Bcl-2和Bax的蛋白水平比例。结论二甲双胍可能是通过AMPK/mTOR和Caspase-3及Bcl-2/Bax两个通路的共同作用诱导JAR细胞发生凋亡。     

JQ1诱导SUP-B15细胞凋亡的Notch1通路机制研究

目的:本研究观察布罗莫结构域抑制剂JQ1诱导人Ph阳性急性淋巴细胞白血病细胞株(SUP-B15)凋亡的Notch1通路可能机制。方法:用不同浓度JQ1在不同时期处理SUP-B15细胞,用四甲基偶氮唑蓝试验(MTT法)检测细胞增殖情况;用流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR法检测MIS2、Notch1、Hes1、BCR-ABL mRNA的表达水平。结果:JQ1在0-4μmol/L的浓度范围内能抑制SUP-B15细胞的生长,并呈现剂量-时间依赖性;JQ1在1、2、4μmol/L处理SUP-B15细胞48 h后,诱导细胞S期阻滞,并呈剂量依赖性,与同时间对照组比较有统计学差异(P0.05);与同时间对照组相比,JQ1能够降低MIS2、Notch1、Hes1、BCR-ABL mRNA的表达。结论:JQ1可以有效抑制SUP-B15细胞生长增殖,而Notch1通路凋亡途径很可能是JQ1促进Ph+ALL细胞凋亡的多途径之一。     

PP242对Ph+急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制作用及对AKT1-Ser473磷酸化的影响

目的观察ATP竞争性哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)抑制剂PP242对体外培养的Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞增殖和AKT1473位丝氨酸磷酸化的影响。方法对Ph+ALL细胞株SUP-B15进行培养及传代,Cell Counting Kit-8比色法检测PP242(100 nM,250 nM,500 nM,750 nM,1 000 nM)处理细胞株SUP-B15后12 h、24 h、48 h细胞生长情况;应用免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测使用PP242(100 nM,250nM,500 nM)培养细胞48 h后AKT1及磷酸化水平情况。结果 100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 000 nM PP242对Ph+ALL细胞株SUP-B15作用12 h、24 h及48 h后,其抑制率:12 h组:10.17%,13.25%,20.13%,22.54%,27.61%;24h组:11.33%,20.54%,36.18%,41.66%,47.27%;48 h组:23.13%,39.24%,55.72%,61.88%,66.93%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);100 nM、250 nM、500 nM PP242处理SUP-B15细胞48 h后,免疫印迹法检测结果显示AKT1蛋白的表达水平无明显变化,而473位丝氨酸(Ser473)磷酸化水平逐渐降低;实时定量RT-PCR检测结果显示,AKT1的mRNA表达无明显变化,绝对定量mRNA结果分别为:0.673±0.124,0.751±0.133,0.689±0.154,与正常对照组(0.679±0.167)相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ATP竞争性mTORC2抑制剂PP242对体外培养的Ph+ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖存在抑制作用,其作用强度呈浓度和时间依赖性;SUP-B15细胞中存在AKT1的表达;PP242在抑制Ph+ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖过程中可下调AKT1Ser473磷酸化水平。     

槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨槲皮素对高糖培养海马神经元凋亡影响的可能作用机制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠,取海马神经元原代培养,分为正常对照组、高糖组、槲皮素组、槲皮素+Akt抑制剂组和Akt激动剂组。各组在不同条件培养基中培养72 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blotting检测各组神经元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率明显升高(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显减少(P0.01);与高糖组比较,槲皮素组、Akt激动剂组细胞凋亡率明显下降(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P0.01)。与槲皮素+Akt抑制剂组比较,槲皮素组细胞凋亡率明显下降(P0.01),p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明显升高(P0.01)。结论槲皮素能够减少高糖培养下海马神经元的凋亡,其作用机制与增加Akt信号通路中Akt蛋白磷酸化的程度,进而增加Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达有关。