人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白- 2（hBMP2）基因片段,构建pcDNA3.1- hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白- 2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1- hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2- cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。     

柚皮苷协同骨形态发生蛋白-2促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

目的 研究柚皮苷（NAR）联合骨形态发生蛋白（BMP）-2对体外培养的成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因ALP、骨钙素（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达的影响。方法 以成骨细胞株MC3T3-E1为体外药效的试验模型,通过Alamar blue法检测第1、4和7天3种不同浓度NAR（10、100和1 000 μmol·L^-1）单独作用以及分别与50 ng·mL^-1 BMP-2联合诱导对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。同时在第4天和7天测定成骨细胞内ALP活性,采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表达。结果 单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激能够促进细胞增殖,在NAR浓度为100 μmol·L^-1时达到高峰（P<0.05）,且该浓度NAR与BMP-2联合作用时增殖效果大于两者单独作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ALP活性,100 μmol·L^-1 NAR与BMP-2联合作用时ALP活性最强（P<0.05）。100~1 000 μmol·L^-1的NAR单独及联合作用在不同程度上能促进ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相关基因表达。结论 NAR能有效促进成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化,且适宜浓度的NAR和BMP-2有协同和促进作用。     

原核表达重组人骨形态发生蛋白-7对牙槽骨修复再生的实验研究

目的研究原核表达重组人骨形态发生蛋白- 7（rhBMP- 7）对牙槽骨修复再生的影响。方法采用新西兰白兔建立动物模型,以明胶海绵作为载体,将大肠杆菌原核表达的rhBMP- 7与之复合后植入即刻拔除牙齿的牙槽窝内进行干预治疗,术后2、4、8及12周处死动物,取标本进行大体观察、扫描电镜分析、碱性磷酸酶（ALP）活性测定。结果大体观察结果显示,实验组和对照组牙槽嵴高度的吸收差异有显著性;扫描电镜观测显示,实验组的骨创愈合比对照组大约提前4～6周;ALP活性测定显示实验组均明显高于对照组,其差异有统计学意义（P<0.05）。结论原核表达rhBMP- 7具有促进新骨修复再生、防止牙槽骨吸收的作用。     

骨形态发生蛋白-2在牙发育各阶段中的表达

目的观察骨形态发生蛋白（BMP）-2在牙发育各阶段中的表达,探讨其作用和意义。方法采用免疫组化法观察BMP-2在8～36周龄的人胎儿牙胚、出生1～22d的乳鼠和出生6周至5个月的犬乳牙发育中的表达。结果BMP-2在胎儿蕾状期和帽状期牙蕾上皮、牙板、成釉器和内外釉上皮均为阳性,在钟状期内釉细胞、中间层、成釉细胞和成牙本质细胞为强阳性,在牙乳头和牙囊为阳性;在乳牙萌出前、萌出期的乳鼠以及生后6周犬牙的成釉细胞、成牙本质细胞、赫特维希上皮根鞘和牙囊为强阳性;在犬乳恒牙替换期的牙根、牙周膜以及靠近牙周膜的成骨细胞为阳性。结论BMP-2是牙发育的重要调控因子,参与牙胚细胞的分化、牙胚的形态发生、牙的萌出和乳恒牙替换各阶段的调控。     

“壳-芯”结构电纺纤维膜对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响

［摘要］　目的　研究载有骨形态发生蛋白(BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)“壳芯结构”静电纺丝纤维膜(PP-B)对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响。方法　通过同轴静电纺丝的方法制备PLGA/PCL-BMP-2纤维膜(PP-B),以不含BMP-2的PLGA/PCL电纺纤维膜(PP)为对照组。通过透射电子显微镜观察PP-B膜的“壳-芯”结构;用ELISA法检测BMP-2的体外释放行为;收集PP-B膜的浸出液培养细胞,用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测其释放的BMP-2对MC3T3-E1细胞的影响;将MC3T3-E1细胞接种到纤维膜上,通过CCK-8法检测1d、3d、5d、7d的增殖情况;以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其7d的活性;用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞接种7d时成骨指标Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达。结果　透射电镜结果表明,同轴静电纺丝法制备的PP-B静电纺丝可形成连续均一的“壳-芯”结构;ELISA结果显示,PP-B膜可以实现BMP-2的持续释放;ALP活性检测结果证实本实验条件下制备的负载BMP-2的同轴静电纺丝支架能保持生长因子的部分活性。CCK-8结果显示PP-B膜和PP膜上的MC3T3-E1细胞在1、3、5、7d都持续增殖;ALP活性检测及染色结果显示PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的ALP活性高于PP膜(P<0.05);实时荧光定量逆转录PCR结果显示接种在PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的相关成骨基因Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达高于PP膜(P<0.05)。结论　本实验制备的PP-B膜能促进MC3T3-E1细胞在体外的早期成骨分化。     

人骨形态发生蛋白2真核表达载体构建及其基因/壳聚糖纳米复合体制备

目的 构建人骨形态发生蛋白（BMP）2的真核表达型载体,并利用其与壳聚糖制备纳米复合体。方法 体外利用双酶切法将pMD18T-hBMP2-His质粒与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建pIRES2-EGFP-hBMP2-His真核表达载体;采用5种不同相对分子质量及脱乙酰度的壳聚糖,通过去溶剂法在不同N/P比（壳聚糖中的胺基含量与质粒中磷酸基含量的摩尔比）情况下制备壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体。ZetaPALS电位及粒度分析仪检测纳米复合体的粒径大小、分布及Zeta电位,琼脂糖凝胶电泳分析及荧光分光法评定壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体的包裹情况,原子力显微镜观察粒径形貌。结果 1）成功构建pIRES2-EGFP-hBMP2-His真核表达载体,并经酶切、测序证实;2）成功制备壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体,壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒具有包裹作用;3）制备的壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His复合体呈球状,粒径为111.7~3 214.2 nm,Zeta电位为4.93~16.79 mV。结论 壳聚糖可与pIRES2-EGFP-hBMP2-His复合形成纳米微粒。     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

骨形态发生蛋白-2、-4、-6、-7和-9差异性介导永生化成牙本质细胞成骨分化

目的 研究永生化成牙本质细胞（immortalized odontoblasts,iODs）的间充质干细胞表型和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2、-4、-6、-7和-9差异介导iODs成骨分化的作用。方法 使用SV40 T抗原永生化成牙本质细胞（odontoblasts）,建立iOD细胞株,并连续检测BMP的内源性表达。使用Ad-Easy技术合成表达BMP和GFP的重组腺病毒,使用MTT试剂盒检测iOD的增殖能力。通过免疫荧光检测iOD的间充质干细胞表面标志物。在体外,使用半定量RT-PCR、碱性磷酸酶活性、茜素红染色及油红O染色检测iOD的成骨和成脂分化能力。最后,使用micro-CT和组织学分析评估体内形成的异位矿化组织的体积和密度。采用SPSS 21.0软件包中的单因素方差分析和Scheffe的多重比较检验对结果进行分析。结果 SV40 T抗原有效地永生化OD。iOD细胞株保持良好的增殖活性,表达间充质干细胞表面标志物并具有多向分化能力。相比BMP-4、-6和-7,BMP-2和BMP-9具有更强的介导iOD的成骨分化作用。结论 ODs和成骨生长因子（如BMP-2和BMP-9）可用作骨组织生物工程的有效策略。     

牵张成骨整复猕猴腭裂模型成骨区骨形态发生蛋白-2的表达

目的观察牵张成骨术整复腭裂新骨形成的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达分布规律。方法猕猴23只以外科方法建立腭裂动物模型。其中实验组动物21只,以牵张成骨术整复其腭部软硬组织缺损,至骨运送盘移动关闭裂隙后原位固定。分别于固定期第1、2、4、6、8、12及24周取材3只实验动物,标本行免疫组化染色,观察其不同时间的表达分布,并与实验对照组及空白对照组结果对比。结果免疫组化实验表明, BMP-2于新骨形成过程中主要存在于成骨细胞胞浆中,在牵张成骨早期新生骨小梁的周围存在大量成骨细胞,染色为强阳性;4~6周时,成骨细胞进一步增多,BMP-2表达也呈现强阳性,表明成骨过程到达高峰;8周时成骨细胞数量减少,BMP-2表达趋于减弱;至12周时,成骨过程已基本完成,免疫组化染色基本无着色。结论术后固定成骨期内,BMP-2的表达与分布是一个由弱变强,达到成骨高峰后,随着新骨改建成熟又逐渐趋弱的动态变化过程。     

含增强型绿色荧光蛋白rhBMP-2基因真核表达载体的构建

目的:构建含增强型绿色荧光蛋白的重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)基因真核表达质粒。方法:采用PCR方法扩增rhBMP-2基因,并在两端添加合适的酶切位点;利用定向克隆技术将rhBMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别插入到载体pIRES的上下游多克隆位点中,两者通过IRES连接,以防止融合表达;重组的pIRES-rhBMP2-EGFP在大肠杆菌DH5α内扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建成功。结果:通过对重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP构建成功,开放阅读框架正确。结论:利用PCR、T/A克隆等分子生物学技术,可成功地将编码rhBMP-2的DNA片段和EGFP片段克隆到载体pIRES中,构建出重组子pIRES-rhBMP2-EGFP。     

转染人骨形成蛋白-7基因对骨髓基质细胞体外生物学活性的影响

目的：观察hBMP-7基因转染对Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶、骨钙素及钙化结节等成骨细胞表型。结果：目的基因转染后细胞形态略有变化，增殖能力无明显改变，凋亡率无明显变化，碱性磷酸酶活性明显增高，骨钙素表达增强，钙化结节增大。结论：hBMP-7基因转染可以加速BMSC向成骨细胞表型转化。hBMP-7基因转染的BMSC有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。     

成骨细胞中Runx2对机械离心力刺激的响应

目的研究机械离心力刺激对MC3T3-E1细胞中Runx2表达的影响,探讨成骨细胞将力学刺激转化为生化响应过程中骨形态发生蛋白（BMP）信号转导通路的作用。方法将MC3T3-E1细胞分成A、B、C、D组,分别使用含10%胎牛血清、10%胎牛血清、100 ng·mL-1 Noggin和100 ng·mL-1 Noggin的DEME培养基预处理24 h,对B、D组加载271×g离心力5 min,A、C组不进行离心加力,其余条件相同。30 min后4组分别同时收获细胞,提取总RNA,并逆转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测Runx2基因表达情况。结果B组Runx2 mRNA表达较A组明显增高（P<0.05）,D组Runx2 mRNA表达比B组表达明显降低（P<0.05）,A、C、D组间表达水平比较差异无统计学意义（P=0.692）。结论BMP信号转导通路参与成骨细胞对机械离心力刺激的响应过程,并可能在成骨细胞对力学信号引起的信息传递级联反应中扮演重要角色。     

骨缝牵引中联合应用骨形态发生蛋白-2和骨保护素的实验研究

目的探索上颌骨在骨缝牵引时加入缓释骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和骨保护素（OPG）对新骨形成的影响。方法以24只杂种犬为研究对象,随机分为A、B、C组。通过手术在上颌骨腭横缝植入自制的新型牵引器。A、C组术后5 d在牵引区附近注射缓释重组人骨形态发生蛋白-2/聚乳酸-羟基乙酸共聚物/纤维蛋白胶（rhBMP-2/PLGA/FS）,B、C组在牵引3周后注射人骨保护素/纤维蛋白胶（rhOPG/FS）。牵引1、2、4、6周后处死动物,采集标本进行组织学染色,并通过组织计量学方法检测腭横缝的组织改建情况。结果A、C组骨缝区成骨细胞功能活跃,透射电镜显示细胞内有大量高尔基复合体、线粒体及粗面内质网。牵引6周时,A、B、C组成骨细胞指数分别为38.5±7.7、35.7±6.5、41.7±11.0,破骨细胞指数分别为5.9±1.0、1.2±0.3、2.8±0.4,骨小梁厚度分别为（38.36±13.28）、（66.20±9.16）、（51.85±9.92）μm;B、C组表现出骨密度增加及破骨细胞指数下降。结论本实验所用牵引器能促进新骨生成;BMP-2与OPG在骨缝牵引过程中有协同作用,可以促进新骨形成及骨改建。     

人骨形成蛋白7荧光真核表达载体的构建及体外生物学活性检测

目的构建携带人骨形成蛋白7（hBMP-7）基因的绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-hBMP-7，体外转染小鼠基质细胞系W-20-17，检测相关生物学活性的变化。方法应用亚克隆法构建真核表达载体pEGFP-hBMP-7，酶切电泳鉴定。脂质体法转染W-20-17细胞，检测瞬时转染效率及目的基因的表达，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶（ALP）、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果48h后，基因转染效率达到4｜D％，报告基因及免疫荧光证明目的基因的表达。目的基因转染后细胞形态未见明显变化，增殖能力无明显改变，ALP活性明显增高，钙结节增多，骨钙素表达增强。结论成功构建了具有生物学活性的pEGFP-hBMP-7，基因转染后能诱导W-20-17细胞向成骨细胞表型转化。     

超声微泡破裂法促进骨形态发生蛋白-2在小鼠骨骼肌表达的研究

目的探讨超声微泡破裂法对基因重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）质粒pIRES-rhBMP2-EGFP在小鼠骨骼肌的转染、表达的促进作用。方法24只BALB/c小鼠随机分为4组,每组6只。A组和B组选择右侧胫前肌为注射点,其中A组注射质粒,B组注射质粒与微泡造影剂混合物后用超声辐照,质粒注射量为30 μg;C组和D组选择右侧股四头肌为注射点,其中C组注射质粒,D组注射质粒和微泡造影剂混合物后用超声辐照,质粒注射量为100 μg。7 d后处死A组和B组小鼠,取胫前肌在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况;14 d后处死C组和D组小鼠,取股四头肌行免疫组化检测rhBMP-2表达情况。结果7 d后B组阳性肌纤维百分率高于A组（P<0.05）;14 d 后,C组和D组都可检测到rhBMP-2的表达,但D组rhBMP-2表达量比C组多。结论超声介导微泡破裂法能增加外源性rhBMP-2基因在小鼠体内骨骼肌转染率和表达水平,有望为牙周病的基因治疗提供一种新型方法。     

Recombinant human bone morphogenetic protein-7 in maxillary sinus floor elevation surgery in 3 patients compared to autogenous bone grafts. A clinical pilot study

BACKGROUND/AIMS: This pilot study was designed to determine the clinical bone formation ability of a human recombinant DNA bone morphogenetic protein-7, also referred to as Osteogenic Protein-1 [OP-1] combined with a collagen carrier, implanted in the maxillary sinus of 3 patients. The results were compared with a group of 3 patients treated with sinus floor elevation and autogenous bone grafts. METHODS: 6 consecutive patients, 4 female and 2 male, between 48 and 57 years of age were treated by means of sinus floor elevation for insufficient bone height in the posterior maxilla for implant surgery. 3 patients, 2 female and 1 male, were treated with OP-1 attached to a collagen device. In these patients, 4 maxillary sinus grafting procedures according to Tatum's method were carried out. 1 g of collagen carrier containing 2.5 mg rhOP-1 mixed with 3 ml of saline was placed between the bony floor and the elevated mucosal lining of the most caudal part of the maxillary sinus, in order to increase the vertical bone dimension to place dental implants of a sufficient length. The 3 other patients, also 2 female and 1 male, with a total of 5 sinus sites, were treated with sinus floor elevation and autogenous iliac crest bone grafts. After 6 months, during dental implant preparation, bone cores were taken for histology. Thus, clinical, radiological and histological results of the 2 groups of 3 patients were compared. RESULTS: 6 months after sinus grafting with OP-1, in 1 male, well-vascularized bone-like tissue of good quality was observed clinically. This could be confirmed by histology. In the second, female, patient no bone formation was observed at all. A cyst-like granular tissue mass, without purulent content, was removed. In the 3rd, female, patient, who received bilateral sinus grafts, some bone-like formation was seen, however it showed flexible tissue which led to the decision that at 6 months after the sinus grafting, the implant placement had to be postponed. In all 5 autogenous grafted sinuses a bone appearance similar to normal maxillary bone was observed clinically as well as histologically and dental implants could be placed six months after sinus floor elevation surgery. CONCLUSIONS: These findings indicate that the OP-1 device has the potential for initiating bone formation in the human maxillary sinus within 6 months after a sinus floor elevation operation. However, the various findings in these 3 patients indicate that the behaviour of the material is at this moment insufficiently predictable, in this indication area. Further investigation is indicated before OP-1 can be successfully used instead of the "gold standard" autogenous bone graft.