维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化

目的:探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelium,hRPE)细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2 ]i的变化。方法:应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12,24及48h,采用吖叮橙(AO)荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡;Fluo-3/AM负载技术,观察凋亡过程中细胞[Ca2 ]i的变化。结果:一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡,荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征:核荧光呈黄绿色,电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示,Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加(F=12.3415,P<0.05)。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度([Ca2 ]i)呈下降趋势(F=23.607,P<0.01)。结论Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡,细胞内[Ca2 ]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。     

视网膜色素上皮细胞凋亡途径的研究

目的研究维拉帕米（verapamil，Ver）诱导体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞凋亡过程的凋亡途径。方法应用80mg·L^-1 Ver作用体外培养的人RPE细胞12h、24h、48h诱导凋亡。RT-PCR及Western blot检测caspase-3及caspase-8表达。结果对照组RPE细胞可见caspase-3的mRNA及蛋白有少量的表达，Ver作用12h、24h、48h时，caspase-3的mRNA及蛋白表达增强。对照组和Ver作用12h、24h、48h组easpase-3与内对照p—actin RT-PCR产物OD比值的平均值分别为0．58±0．08、0．89±0．12、1．22±0．14及1．18±0．09，组间比较，差异有显著意义（F=19．22．P〈0．05）。本实验条件下未发现caspase-8的mRNA及蛋白表达。结论Ver诱导体外培养人RPE细胞凋亡可能是通过细胞内途径完成的。     

Bcl-2及bFGF在维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的表达

目的探讨维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡作用,观察凋亡过程中原癌基因蛋白质(Bcl2)和碱性成纤维细胞生长因子(baic fibroblast growth factor,bFGF)的表达变化。方法应用80mg·L-1Ver作用于体外培养的人RPE细胞12h、24h、48h,吖啶橙(acridineorange,AO)荧光染色及透射电镜观察RPE细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Bcl2mRNA和bFGFmRNA表达变化。结果经Ver作用的体外培养的人RPE细胞具有典型的凋亡形态学特征:核染色质浓染、边集;细胞体积缩小。同时RPE细胞Bcl2mRNA表达下降;而bFGFmRNA表达随着作用时间延长,呈增高趋势。结论Ver可诱导体外培养人RPE细胞凋亡,凋亡过程中Bcl2表达逐渐下降,而bFGF表达增强。     

不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca2+的影响

目的:探讨不同浓度维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞内Ca2+浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca2+浓度的变化。方法:2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/LVer作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)测定细胞内Ca2+荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果:Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义(P>0.05),Ver可降低RPE细胞内Ca2+荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca2+荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异(P<0.05)。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca2+荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异(P>0.05)。结论:超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca2+荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca2+有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca2+荧光强度无明显作用。     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

细胞内Ca2+及MERTK基因在人视网膜色素上皮细胞吞噬功能中的作用

目的 观察细胞内Ca2+及MERTK基因在人视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬功能中所起的作用及二者的相互关系。方法 用视细胞外节膜盘（ROS）于37℃孵育培养的RPE细胞,在孵育不同终止吞噬反应。双重荧光标记法检测 RPE细胞吞噬动力学;钙离子荧光探针负载法在荧光显微镜下测定RPE细胞内Ca2+的变化;半定量逆转录聚合酶链反应（RT PCR）法检测相应时间点MERTK 基因表达的变化及施加Ca2+激活剂 （A23187载体）或拮抗剂（verapamile）后MERTK 基因表达的变化。结果 RPE细胞与ROS孵育过程中,ROS结合于RPE细胞表面发生在15 min时,RPE细胞吞噬ROS在24 h时达到饱和。细胞内Ca2+在孵育15 min 时升高,并在24 h内保持高水平;MERTK 基因表达在RPE细胞与ROS孵育5 min时增强,并在全部孵育过程中呈现出高表达状态;以A23187载体开放钙通道升高RPE细胞内Ca2+后,MERTK 基因信使核糖核酸（mRNA）水平升高,并呈剂量依赖性。经A23187预处理后的孵育实验中所检测到的MERTK mRNA水平除3 h 这一时间点外均高于对照组; verapamile拮抗RPE细胞内Ca2+后,MERTK 基因表达明显下降并呈剂量依赖性;以verapamile预处理后继续与ROS孵育,所检测到的MERTK基因在24 h内均低于对照组。结论 MERTK基因及细胞内Ca2+发挥着维持RPE细胞吞噬过程的重要作用,MERTK作为上游调控信号启动下游的细胞内Ca2+信号来维持RPE细胞对ROS的摄入过程。     

不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca^2＋的影响

目的：探讨不同浓度维拉帕米（verapamil,Ver）对体外培养豚鼠视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞内Ca^2＋浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca^2＋浓度的变化。方法：2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/L Ver作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光（均为将平行光经透镜转化）和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscopy,LSCM）测定细胞内Ca^2＋荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果：Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义（P〉0.05）,Ver可降低RPE细胞内Ca^2＋荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca^2＋荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异（P〈0.05）。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca^2＋荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异（P〉0.05）。结论：超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca^2＋荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca^2＋有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca^2＋荧光强度无明显作用。     

吡哆胺对AGEs干预的人RPE细胞的保护作用

目的：观察吡哆胺(PM)对高级糖基化终末产物(AGEs)干预的RPE细胞的影响,探讨PM对RPE细胞的保护作用。

方法：取传代至第3代的细胞进行分组：(1)对照组：含100mg/L BSA的DMEM培养基培养48h;(2)AGEs干预组：含200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h;(3)PM组：PM1组：含16mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h; PM2组：含32mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h。采用免疫组织化学法检测RAGE蛋白的表达; 荧光染色法观察细胞内ROS的生成; Tunel法检测细胞凋亡情况。

结果：AGEs可明显刺激RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS的生成,增加细胞凋亡情况,而PM可抑制该过程,且具有一定的浓度依赖性。

结论：PM能够抑制AGEs干预的RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS生成,减少细胞凋亡,具有一定的细胞保护作用。     

蛋白酪氨酸激酶抑制剂对RPE细胞趋化因子表达和Ca2+的影响

目的 研究蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)抑制剂染料木黄酮(Genistein)对白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞趋化因子表达和细胞内Ca2+的影响.方法 应用不同剂量IL-1β对RPE细胞进行刺激,RT-PCR法观察细胞IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaetic protein-1,MCP-1)mRNA表达的变化.应用Genistein对RPE细胞培养进行干预,观察其对IL-1β诱导RPE细胞IL-8和MCP-1 mRNA表达的影响.应用Fura2/AM、荧光分光光度计检测IL-1β和Genistein对RPE细胞内Ca2+的影响.结果 RT-PCR结果显示,0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组IL-8 mRNA相对表达值分别为0.446±0.133、0.727±0.054和0.523±0.106,对照组为0.272±0.088;1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001、0.015).10μg·L-1IL-1β诱导的RPE细胞MCP-1 mRNA相对表达值与对照组比较,差异有显著统计学意义(P=0.002).10 mg·L-1、50 mg·L-1 Genistein对IL-1β诱导的IL-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01).IL-1β引起细胞内ca2+浓度升高,Genistein对细胞内Ca2+作用与之相反.结论 Genistein对IL-1β诱导的1L-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,其机制可能为抑制IL-1β诱导的细胞内Ca2+增加.     

染料木素对体外培养的牛眼小梁细胞[Ca2+]i的影响

目的:在激光扫描共聚焦显微镜(laserscanning confocal microscopy,LSCM)下测定小梁细胞经染料木素(genistein,Gen)作用后钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。方法:运用组织块培养法获得三代牛眼小梁细胞,Fulo-3/AM负载后,于LSCM下动态扫描不同浓度Gen作用后胞内荧光强度变化,得出[Ca2+]i值。结果:10-6,10-5,10-4mol/LGen可使小梁细胞[Ca2+]i呈剂量依赖性降低,其中10-5mol/LGen可使小梁细胞[Ca2+]i由328.62±16.77nmol/L减少至309.69±16.57nmol/L(n=8,P<0.05)。结论:Gen可通过松弛小梁网而致房水流出阻力减小、眼压下降。     

重组人促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞光化学损伤保护性作用的研究

目的研究重组人促红细胞生成素（rhEPO）在人视网膜色素上皮（RPE）细胞光化学损伤中的保护作用及其作用机制,为年龄相关性黄斑变性等眼部病变的药物治疗和预防提供理论依据。方法为实验研究。取成人ARPE-19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型,光照12h后再培养24h终止培养,采用噻唑蓝比色法和AnnexinV-FITC／PI流式双染法检测不同浓度的rhEPO干预治疗前后RPE细胞活性的变化及细胞凋亡的变化,采用酶联免疫吸附实验和免疫组织化学法定量检测不同含量rhEPO干预治疗前后RPE细胞caspase-3表达的变化,并添加AG490（Jak2激酶抑制剂）探讨重组人EPO对人RPE细胞光化学损伤的保护性作用和途径及其保护性机制。结果rhEPO可明显增强RPE细胞的活性,以40U／mLEPO组结果最明显;明显减少光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡,以40U／mLrhEPO组结果最明显。在加入AG490组,rhEPO对细胞活性的增强作用和抑制凋亡作用均被阻止。结论rhEPO对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用,主要通过EPO的受体后保护作用机制起作用,即通过与受体结合,激活Jak2激酶的途径实现的。（中华眼科杂志,2008,44：50-55）     

可见光对培养的人视网膜色素上皮细胞内碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子受体1、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因及 caspase-3的影响

目的　观察可见光诱导的培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞凋亡中 ,RPE细胞内碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、成纤维细胞生长因子受体 1(FGFR1)、B细胞淋巴瘤 /白血病 2基因(bcl 2 )及caspase 3的表达变化。方法　建立可见光诱导培养的人RPE细胞凋亡的模型 ,通过细胞免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)、酶联免疫测定等方法 ,对培养的人RPE细胞内bFGF和其受体FGFR1的mRNA表达变化、Bcl 2表达改变以及caspase 3的活性变化进行了检测。 结果(1)光照后 6及 12h ,培养的人RPE细胞胞质内Bcl 2蛋白的表达有一定的下降趋势 ,但与无光照组之间差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。光照后 2 4h ,Bcl 2蛋白表达下降明显 (P <0 0 1)。bcl 2mRNA表达与上述蛋白表达变化相似 ,但早在光照 12h后已能检测到其表达下降。 (2 )光照后 6hbFGF及FGFR1的表达尚无明显改变 (P >0 0 5 ) ,随着时间延长 ,其表达增加的差异具有显著意义(P <0 0 5 )。(3)光照后caspase 3活性随时间延长而明显增加 ,与未光照时比较 ,光照结束后 6、12及2 4h活性差异有显著意义 (P <0 0 5 )。 12和 2 4h间差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　可见光照诱导培养的人RPE细胞凋亡时 ,RPE细胞内bcl 2表达下降 ,内源性bFGF及FGFR1上调 ,caspase 3     

Effect of Hypericin on Confocal Imaging of Ca~(2 ) Signaling in Cultured Human Retinal Pigment Epithelium

Purpose:To investigate the mechanism of the Ca^2 signaling in cultured human retinal pigment epithelial(RPE) cells with the protein kinase C(PKC) specific inhibitor-hypericin stimulation.Methods: Cultured human RPE cells were analyzed using the fluorescence Ca^2 dye fluo-3 AM and laser scanning confocal microscope(LSCM) after stimulation with 100nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)and (or)5 concentrations of hypericin(1,2,3,4and 5μM)。Results:The normal fluorescence in RPE cells was strong and distributed throughout the cells,The nucleus appeared to be more fluorescent than the cytoplasm.After stimulation with PMA alone or 5 concentrations of hypericin,a rapid decrease in flurescence intensity was observed.There was no obvious difference in decreased curve among 5 concentrations,However,after stimulation with a 24 hr preincubation of PMA and 5 concentrations of hypericin,a further decrease was not observed.Conclusion:Fluo-3 AM appears to be a good indicator of the change in Ca^2 occurring in RPE cells and hypericin is a strong inhibitor of Ca^2 influx channel,Hypericin has potential as a therapeutic drug for proliferative vitreoretinopathy(PVR),the inhibitory effect on PVR might be caused by blocking the PKC activity and inhibiting Ca^2 influx Pathway.Eye Science 2001;17:148-153.