小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的：观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法：实验于2005—02／06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13．5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞，用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养，取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶，用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。（爹四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果：①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达：血清诱导8h，分化细胞中（8．9&;#177;5．6）％细胞呈Tubulin阳性，（87．5&;#177;7．4）％细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100％呈巢蛋白阳性，仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期：从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期；原代培养细胞83．8％处于静止期／DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA，聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论：从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞．并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖，血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

多聚赖氨酸和明胶对神经干细胞增殖和分化的影响

背景:目前大鼠神经干细胞体外诱导分化的研究报道诸多,但其分化过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低.目的:探索大鼠胚胎前脑神经干细胞体外原代及传代培养方法,并观察其分化规律.方法:胎鼠在无菌条件下分离出前脑,制备单细胞悬液,以1×1011L-1接种于含N2的DMEM/F12培养基中培养,传代培养过程中加入BrdU,标记神经干细胞球.诱导分化实验分为多聚赖氨酸铺板组、明胶铺板组和无铺板组.采用体积分数20%胎牛血清刺激其分化.免疫细胞化学检测nestin、BrdU及在血清诱导条件下神经干细胞向神经细胞分化的能力.结果与结论:细胞呈神经干细胞样生长,具有连续增殖能力,可以传代培养.传代神经球中的细胞均呈nestin阳性和BrdU阳性.多聚赖氨酸铺板组和明胶铺板组贴壁后分化为神经细胞能力强于无铺板组(P < 0.01).多聚赖氨酸铺板组略强于明胶铺板组(P > 0.05).神经谱系标记物神经胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的免疫细胞化学结果均阳性.结果表明,大鼠胚胎前脑富含神经干细胞,其分化观察,多聚赖氨酸和明胶在诱导神经干细胞分化中作为细胞贴壁支持物提高分化细胞数量的作用,且多分化为星形胶质细胞.     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养**

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清 DMEM 培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物 nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU 掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数1O％胎牛血清的DMEM,F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestir。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6．0％-7．0％;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37．9％。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型B微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化

背景：体外分离培养出神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：采用神经球方法分离培养胎鼠皮质神经干细胞,并观察其生长和分化特性。方法：利用无血清悬浮方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,用免疫细胞化学的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果与结论：体外无血清含生长因子的培养液培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球呈巢蛋白表达阳性,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,但主要向神经胶质细胞分化。说明在血清含有生长因子的而培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞。     

体外自组装IKVAV纳米纤维凝胶在二维体系中对神经祖细胞分化的影响

背景：大量实验证明体外自组装的纳米支架材料可以促进神经祖细胞增殖与分化。目的：观察体外自组装含IKVAV纳米纤维凝胶在二维体系中对神经祖细胞分化的影响。方法：培养SD大鼠乳鼠神经祖细胞并用免疫荧光方法鉴定。在DMEM/F12触发下,含IKVAV的两亲性多肽溶液形成三维多孔凝胶,于透射电镜下观察其结构。将神经祖细胞分别接种到1%含IKVAV的两亲性多肽溶液及0.1g/L多聚赖氨酸包被的盖玻片上,培养1,3,7d后采用神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白检测其分化情况。结果与结论：培养出巢蛋白阳性细胞,并且能分化为神经丝蛋白阳性的神经元与胶质纤维酸性蛋白阳性的胶质细胞,证实为神经祖细胞;含IKVAV的两亲性多肽溶液自组形成凝胶,并在透射电镜下显示为纳米纤维,直径为7.0－8.0nm,长度为100－1500nm;IKVAV的两亲性多肽溶液组向神经元分化得能力明显优于多聚赖氨酸组。说明体外自组装IKVAV纳米纤维凝胶在二维培养体系中对神经祖细胞分化有一定的促进作用。     

人类皮肤来源前体细胞的表型和特征

背景：研究证实,从人类的皮肤中成功分离出皮肤源性前体细胞并在体外长期培养,可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞以及具有周围神经元表型的细胞和许旺细胞。目的：进一步证实人皮肤组织来源的多能干细胞的培养方法和多方向分化能力,尤其向神经细胞、成骨细胞分化的可能性。方法：采用胰蛋白酶消化法培养人皮肤组织来源的前体细胞,应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。取三四代的细胞分别进行神经元诱导分化、成骨细胞诱导分化、yonKossa法钙染色、软骨细胞诱导分化、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色及苏丹黑染色。观察皮肤来源的前体细胞巢蛋白、波形蛋白、βⅢ管蛋白、S100及Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：用胰蛋白酶消化法培养出人皮肤组织来源的前体细胞,增殖聚集能够形成悬浮的细胞球,在培养的不同时间都可检测到巢蛋白阳性的细胞。培养的全部细胞表达波形蛋白,在贴壁的细胞中也能检测到βⅢ管蛋白的表达。利用丹参诱导皮肤源性前体细胞向神经元样细胞分化,表达神经细胞的标志物。应用成骨细胞诱导,yonKossa染色发现培养皿中有黑色的钙化结节产生,说明皮肤源性前体细胞能够分化为成骨细胞;将皮肤源性前体细胞向软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色强阳性,部分细胞表达Ⅱ型胶原,证明分化的细胞中含有软骨细胞。实验结果证实,皮肤中存在的多能干细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、许旺细胞和少突胶质细胞。     

胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病

背景：胚胎干细胞移植是否能够成为脑血管疾病治疗有效的方法已成为目前研究的热点。目的：探讨胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗脑血管疾病的效果及可行性。方法：分别建立帕金森病、缺血性脑损伤以及血管性痴呆大鼠模型,并进行胚胎干细胞体外培养,诱导分化为神经前体细胞,将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入相应脑血管疾病模型大鼠脑内,观察脑血管病变大鼠的旋转行为学变化、脑组织病理变化以及海马结构的变化和神经细胞数目的变化。结果与结论：胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入帕金森病大鼠脑内后,阿朴吗啡诱发的旋转次数逐渐减少,呈下降趋势,纹状体多巴胺的含量明显增高。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入缺血性脑损伤大鼠脑内后,能够长期存在于脑内,并迁移、分布于受损的海马,构成海马结构,进一步分化为神经元,并且受损海马内的神经细胞数量明显增加。说明移植的胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能,增强神经的可塑性,诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。     

星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

目的:研究表明,星形胶质细胞产生一系列可溶性因子和膜相关因子,对中枢神经系统的发育和功能的成熟起了重要的作用。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,探讨星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法:实验于2005-03/2006-02在广西医科大学实验中心完成。①实验材料:生后0～2d新生SD大鼠由广西医科大学实验动物中心提供。②实验方法:分离培养新生大鼠海马神经干细胞。采用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化新生大鼠脑组织星形胶质细胞,以胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞,应用免疫细胞化学染色法进行细胞纯度鉴定。将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养:共培养组是将培养瓶中的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入完全培养液,待细胞均匀长满后,换神经干细胞基础培养液,孵育24h后,将涂有多聚赖氨酸的盖玻片放入6孔板中,将传代1个月的神经干细胞球种到盖玻片上,同时更换神经干细胞基础培养液继续培养。对照组是单纯接种神经干细胞球于置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板内。③实验评估:采用免疫细胞化学染色法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和酪氨酸羟化酶表达。结果:纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性,细胞纯度达95%。星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元细胞,包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生,可能是星形胶质细胞及其分泌的因子维持并延长了神经元存活,降低了凋亡比率所致。