PCR在血液病原菌16S rRNA基因检测的诊断价值

目的 为早期诊断败血症,探索一种能快速检测病原菌感染的新方法.方法 用PCR技术扩增实验室保留株10株的16S rRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色假丝酵母菌为对照,检测该方法的特异性;采用10倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测.结果 对所测病原菌株均获得371 bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色假丝酵母菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×104/L大肠埃希菌.结论 16S rRNA基因PCR检测方法具有快速,特异性和敏感性高等特点.     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的应用

目的 建立基于16S rRNA基因的聚合酶链反应(PCR)细菌学检测方法,以指导临床快速诊断新生儿败血症.方法 以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件设计合成所有细菌保守区共有的一对通用引物,通过PCR扩增已知10株实验室保存菌株、人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌和空白对照,并对其灵敏度和特异性作一评价.结果 对所测已知10株实验室保存菌株均获得920 bp扩增产物,其与人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无交叉阳性反应;PCR阳性率为26.8％,血培养阳性率为11.3％,两者比较有差异有统计学意义(P＜0.05),PCR灵敏度高于血培养.结论 与血培养比较,PCR具有检测速度快、特异性及敏感度高等特点.     

细菌性感染PCR诊断方法的建立及其应用研究

目的通过通用引物PCR,为建立一种实用、快速可靠细菌感染PCR检测方法奠定基础。方法收集100例疑似血流感染患者的血液进行细菌培养,同时检测细菌16S rRNA基因,测定和分析所得DNA序列,对培养结果与PCR结果进行比较;采用倍比稀释法进行PCR灵敏度检测。结果 100份血液标本中细菌培养8份阳性,阳性率为8.0%;PCR法19份阳性,阳性率为19.0%,细菌培养与PCR检测结果比较,差异有统计学意义(χ2=9.09,P<0.05);测序结果显示DNA序列与GenBank公布的基因序列同源性很高,PCR可检测范围至1.5×102CFU/ml。结论只要严格控制污染,通过16S rRNA基因PCR技术对疑似血流感染的临床诊断具有重要意义。     

PCR技术在前列腺液细菌检测中的应用

目的 应用聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性前列腺炎患者前列腺液中病原菌的阳性率.方法 收集97例慢性前列腺炎患者的前列腺液,分别用16S rRNA基因PCR方法和细菌培养法进行检测,比较两种方法检测 病原菌的敏感性.结果 97例慢性前列腺炎患者前列腺液中,PCR方法检测出58例,阳性率为59.79％,培养法检出10例,阳性率为10.31％,PCR方法检出率明显高于培养法(P＜0.01).结论 16S rRNA基因PCR检测方法具有快速,特异性和敏感性高等特点.     

实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

p16基因异常甲基化检测在非小细胞肺癌中的应用研究

应用甲基化特异性PCR技术检测 2 1例非小细胞肺癌、18例良性肺部疾病的手术切除标本及对应的支气管肺泡灌洗液。结果表明 4 7.7%的肺癌组织标本呈现p16基因异常甲基化。在检出异常甲基化的肺癌患者的对应支气管灌洗液中 ,70 %也检出甲基化存在。而肺部良性疾病患者在手术切除标本和支气管灌洗液标本中均未检出p16基因甲基化存在。     

运用23S rDNA芯片技术进行食源性感染常见致病菌的快速鉴定

[目的]应用23S rDNA芯片技术，建立食源性感染常见致病菌的快速鉴定方法。[方法]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体，合成寡核苷酸探针，点样于载体制成寡核苷酸芯片，对食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。[结果]获得扩增食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段的特异性引物，并在同一条件下扩增出14种细菌目标片段。在均一的杂交条件下与寡核苷酸芯片杂交，用地高辛酶联免疫法进行显色。结果表明，10种细菌杂交结果显示很好的灵敏度和特异性，4种细菌由于探针因素或杂交条件不合适未能显示预期的种(属)杂交结果。对于食源性感染模拟标本，本方法也可以获得预期的结果。[结论]建立的23S rDNA芯片技术在食源性感染常见致病菌鉴定上快速准确的优点，为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。     

通用引物PCR扩增创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的研究

目的 探讨通用引物PCR扩增多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的可行性,为开展常见创伤感染细菌基因诊断做好准备.方法 以细菌16S-23S rDNA间区为靶序列,在16S rDNA 3'端与23S rDNA 5'端保守区自行设计通用引物,筛选5种常见创伤感染细菌,提取其基因组DNA并进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序.结果 5种细菌基因组DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与预期一致,经测序比对后得到了证实.结论 该通用引物可以实现对多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区进行PCR扩增,为下一步进行基因诊断打下了坚实的基础.     

幽门螺杆菌在胃和口腔中感染的检测

目的：检测在胃和口腔样品中幽门螺杆菌的感染。方法：采用脲酶实验及PCR方法检测幽门螺杆菌。结果：脲酶试验检测不到幽门螺杆菌在口腔中的感染，而使用PCR却有很高的检出率。使用同种引物PCR对胃粘膜样品和口腔样品的培养液进行检测，胃中的检出率不如口腔中的高。结论：两种检测方法，以PCR更为特异、灵敏。口腔是幽门螺杆菌的重要寄居场所。     

军团菌16SrRNA聚合酶链反应方法的建立及应用

建立了１６ＳｒＲＮＡ基因检测军团菌的多聚酶链反应方法。扩增参考菌株染色体ＤＮＡ（Ｌ．Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ１～１４、Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｎｉ、Ｌ．ｄｕｍｏｆｉ、Ｌ．ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ、Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ、Ｌ．ｊｏｒｄａｎｉｓ）,均可检出出３８６ｂｐ的基因片段,敏感性为１０３ｃｆｕ／ｍｌ（平均值）;而扩增９株非军团菌均为阴性。对模拟血标本的检测,其敏感性可达１０２ｃｆｕ／ｍｌ。应用本检测系统检测了２４例临床标本,包括１９份血、５份胸水,阳性率为７０．８％（１７／２４）。与血清学检测和临床诊断治疗结果相符合。上述结果表明该方法敏感、特异、快速、简便。     

不同16S rDNA引物对肠道菌群分析差异的比较

目的分析不同16s rDNA"通用引物"扩增靶序列在研究肠道微生物菌群分析时的差异,为选择合适的通用引物扩增肠道微生物菌群提供基础数据。方法从一健康成人的粪便中提取总DNA,以两对"通用引物"27F/519R和27F/533R扩增16S rDNA序列,扩增产物分别克隆到PGEM-T载体,建立克隆文库;两个克隆文库分别挑取65个克隆进行测序,通过序列同源性比对和构建系统发育树,比较两对引物在分析肠道菌群多样性上的差异。结果成功构建了L519和L533克隆文库,阳性克隆率分别达到95.3%和92.3%。533文库和519文库中非培养或不可培养的克隆比例分别占69.1%和76.6%(P0.05)。两文库优势菌群相同,均为梭状芽孢杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌和变形杆菌,但各菌群的比例及低丰度菌群的分布稍有差异;在种群多样性上,533文库和519文库中分别得到22个和17个可操作分类单元,533文库比519文库有更丰富的种群多样性(P0.05)。结论在分析肠道菌群多样性时,引物27F/533R较27F/519R有更好的兼并性,更适宜于进行肠道菌群结构和多样性的分析。     

16S rDNA序列分析法在国际船舶压载舱沉积物病原微生物检测中的应用

〔目的〕探讨16S rDNA序列分析法在国境口岸监测外来病原微生物的可行性。〔方法〕按照0.5 mg/0.5 ml样品接种10 ml增菌液的比例将压载舱淤泥样品分别接种到营养肉汤和碱性蛋白胨水中,37℃过夜,震荡摇匀。增菌后划线接种在选择培养基上,过夜培养后挑取阳性菌落纯培养,按照试剂盒说明提取细菌基因组,扩增细菌基因组16S rDNA片段,将扩增产物纯化后进行序列分析。〔结果〕从48份样品中共检测12种细菌,其中检测到的霍乱弧菌有1株为B33株。这株霍乱弧菌最早在2004年分离自非洲东南部国家莫桑比克的贝拉港,是O1群霍乱弧菌的经典型与Eltor型杂交后产生的菌株,O139群霍乱弧菌尚未检测到。〔结论〕16S rDNA序列分析法可用作国境口岸外来微生物的监测和分析。     

基于下一代测序技术的献血者血液细菌16S rDNA检测及分析

目的 基于下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术检测献血人群血液16S rDNA宏基因组,用于分析无偿献血者血液中细菌的分布情况.方法 收集20例无偿献血者抗凝全血并制备相应血浆标本,分别作为待测标本.随机选取另1例献血者血液制备成全血和血浆标本后,加入金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌...     

无症状HBsAg携带者血清HBV DNA定量检测的评估

目的　探讨一种新的高灵敏度血清 HBV DNA水平检测方法以及病毒 DNA检测用于献血员筛选的可行性。方法　采用 Am pli Sensor定量荧光 PCR技术定量检测经 EL ISA法筛选的 32 1名健康志愿者和37名 HBs Ag携带者血清 HBV DNA水平。结果　 32 1名志愿者中 2名 HBV DNA阳性 (0 .6 % ) ;37例 HBs Ag携带者 DNA检出率 1 0 0 % ,但 DNA含量相差较大 (7.98± 5 .37)。结论　 Ampli Sensor定量荧光 PCR技术灵敏度可达对数值 1拷贝 /毫升 ,该法用于献血员病毒 DNA检测有一定意义 ,但更适合用于临床健康检查 ;同时发现 HBV在无症状 HBs Ag携带者体内病毒复制差异较大 ,可能与不同个体的免疫状况有关。     

核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用

从建立PCR标准化实验室,制定标准操作规程;强化人员培训;正确选择设备设施,做好校准、维护与保养;选择合格的实验耗材;制定严格的防污措施,做好环境质控;做好检测环节质控;确保记录完整等方面,总结了核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用实践.     

布鲁菌16S rDNA基因遗传分析

目的通过分析临床分离的布鲁菌、其他盐杆菌科细菌以及临床常见致病菌的16SrDNA基因片段的差异并构建16SrDNA系统发育树,为进一步研究布鲁菌打下基础。方法 PCR扩增临床分离株的16SrDNA并测序;从EMBL下载常见盐杆菌科细菌和临床上常见致病菌的16SrDNA序列。利用CLUSTALX和MEGA程序进行16SrDNA比对并构建系统发育树。结果成功扩增了临床分离菌株的16SrDNA,得到测序结果,比对临床分离菌株和相关菌株后,发现了特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′;系统发育树表明不同种的布鲁菌间的距离非常接近;布鲁菌和醋菌属的进化距离较近,但是和其他的盐杆菌的进化距离较远。结论在布鲁菌16SrDNA中存在特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′,有可能作为探针来快速检测布鲁氏菌。     

应用聚合酶链反应（PCR）检测血清HBV—DNA

用ＰＣＲ技术检测２１３分血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ，ＥＬＩＳＡ法检测其血清五项标志（ＨＢＶＭ）。结果表明，在不同类型的ＨＢＶ感染标志物中其血清ＰＣＲ结果有所不同。１０例健康正常人血清无１例检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，２０３例免疫标志各异的血清共检出５４例存在ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

PCR rDNA 16S dans le diagnostic étiologique des endocardites infectieuses à hémocultures négatives

We report the case of a 55 year-old man presenting with a double aortic and mitral endocarditis for which resected valve culture was repeatedly negative. Specific PCR made on valves because of highly positive blood tests for Bartonella henselae remained negative. A molecular approach was made with 16S rDNA PCR, followed by sequencing. Bartonella quintana was identified as the etiology of endocarditis. B. quintana, “fastidious” bacteria, even if hard to identify in a laboratory, is often reported as a blood culture negative endocarditis (BCNE) agent. Molecular biology methods have strongly improved the diagnosis of BCNE. We propose a review of the literature focusing on the interest of broad-spectrum PCR on valve for the etiological diagnosis of BCNE.     

乳酸杆菌及嗜热链球菌的种水平鉴定——16SrRNA基因PCR扩增及序列分析

目的建立鉴定乳酸杆菌及嗜热链球菌的16SrRNA基因PCR方法。方法优化细菌DNA提取方法及PCR反应条件,将细菌16SrRNA基因的PCR产物克隆到质粒载体上并进行序列分析,以对乳酸杆菌酸奶分离株进行鉴定。结果 16SrRNAPCR鉴定方法将50株益生菌酸奶分离株分为7个种,分别为:保加利亚乳酸杆菌24株、嗜热链球菌12株、嗜酸乳酸杆菌7株、干酪乳酸杆菌3株、德氏乳酸杆菌2株、发酵乳酸杆菌1株及巴黎链球菌1株。结论建立的16SrRNA基因PCR方法灵敏、可靠,适用于乳酸杆菌及嗜热链球菌的鉴定。