反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

肿瘤转移相关基因1在人骨肉瘤细胞的表达与转移侵袭的关系

目的比较肿瘤转移相关基因(MTA1)在人骨肉瘤细胞高低转移株的表达水平,探讨MTA1表达水平与骨肉瘤细胞转移潜能的相关性。方法采用半定量逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)检测MG-63骨肉瘤细胞高低转移株MTA1的表达情况,用Boyden小室体外侵袭实验检测两株MG-63细胞的体外侵袭力;用脂质体介导的MTA1基因转染MG-63低转移株细胞,通过 RT-PCR检测MTA1的表达;Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后细胞侵袭力的变化。结果 RT-PCR结果显示MTA1在MG-63低转移细胞株中表达水平低(1．32),在高转移细胞株中表达水平高(6．27,P<0．05);Boyden小室体外侵袭实验显示MG-63高转移株细胞体外侵袭力强,其穿膜细胞相对百分率为(46．3±2．4)％,低转移株细胞体外侵袭力较弱,其穿膜细胞相对百分率(12．6± 1．1)％,两者差异有统计学意义(P<0．05);转染MTA1基因后,低转移细胞株转移潜能较未转染细胞明显增高。结论 MTA1与人骨肉瘤细胞转移潜能有密切关系。     

NS-398对骨肉瘤细胞的作用及其对Survivin表达的影响

目的：观察选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对人骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡的影响及其对survivin基因表达的影响。方法：体外培养骨肉瘤细胞系MG-63，应用MTT法研究不同浓度NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63的凋亡诱导作用，流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡率的变化，RT-PCR法分析NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63中survivin基因表达的影响。结果：NS-398可诱导骨肉瘤细胞系MG-63发生凋亡，并具有剂量依赖性，在NS-398浓度为200μmol／L时，对细胞生长有明显的抑制作用。流式细胞仪检测显示NS-398引起MG-63细胞凋亡率增加。RT-PCR分析显示经NS-398作用后的骨肉瘤细胞系MG-63表达survivin较用药前明显下降。结论：NS-398对骨肉瘤细胞系MG-63有杀伤作用，其作用可能通过抑制survivin的表达，促进肿瘤细胞的凋亡而实现。     

miR-200c通过AKT2对骨肉瘤细胞增殖的影响

[目的]探讨过表达mi R-200c通过对AKT2的相关调控对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的依据。[方法](1)检测mi R-200c在正常成骨细胞和4种骨肉瘤细胞株中的表达差异;(2)将mi R-200c转染至骨肉瘤细胞株MG-63中,构建稳定过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株;(3)预测mi R-200c与AKT2基因的相关结合位点,构建相应的荧光素酶基因表达载体,连同过表达mi R-200c质粒共转染至骨肉瘤细胞株MG-63中;(4)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63荧光素酶活性;(5)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达水平;(6)观察两组骨肉瘤细胞株MG-63的增殖能力。[结果](1)与正常成骨细胞(NHOst)相比,mi R-200c在4种骨肉瘤细胞株(HOS、U2OS、Saos-2、MG-63)中表达量明显降低(P0.05);(2)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2 3′-UTR序列结构野生型(WT)的荧光素酶活性明显降低(P0.05),而突变型(MUT)的荧光素酶活性无明显差异(P0.05);(3)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c的骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达明显降低(P0.05);(4)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株MG-63增殖能力明显下降(P0.05)。[结论]mi R-200c在骨肉瘤细胞中低表达,而过表达mi R-200c通过靶向调控AKT2表达抑制骨肉瘤细胞的增殖。因此mi R-200c可能对未来骨肉瘤的预防及治疗提供新的策略。     

塞来昔布抑制骨肉瘤细胞黏附侵袭及其机制

目的 观察环氧合酶2(COX-2)抑制剂塞来昔布对骨肉瘤MG-63和U2-OS细胞增殖、黏附和侵袭的抑制作用,探讨其分子机制.方法 采用噻唑蓝(MTF)比色法、黏附实验、侵袭实验、流式细胞术和Western blot研究25、50、100 μmol/L 3种浓度塞来昔布对两种细胞株增殖、黏附、侵袭能力及CD44和基质金属酶(MMP)-9表达的影响.结果 3种浓度的塞来昔布作用48 h后MG-63细胞增殖抑制率分别为9.35%、42.68%、60.29%(P＜0.05),对U2-OS细胞的抑制率分别为2.59%、8.95%、29.36%(P＜0.05).对MG-63的黏附抑制率分别为8.6%、21. 5%、52.8%(P＜0.05);对U2-OS的黏附抑制率分别为1.6%、3.8%、19.0%(P＜0.05);对两种骨肉瘤细胞的侵袭能力、CD44和MMP-9的表达均有抑制作用,对高表达COX-2的MG-63的抑制效应更加显著.结论 塞来昔布可抑制骨肉瘤细胞的增殖、黏附和侵袭,这种作用与下调CD44和MMP-9的表达有关,此种效应具有COX-2依耐性.     

染料木黄酮对骨肉瘤细胞增殖及侵袭的影响及作用机制

目的 探讨染料木黄酮对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭的影响及其作用机制.方法 用染料木黄酮处理MG-63细胞,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室体外侵袭实验法检测MG-63细胞侵袭能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别检测MG-63细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2／MMP-9的mRNA及蛋白水平.结果CCK-8法表明染料木黄酮处理组MG-63细胞增殖被明显抑制,抑制率最高(85.3±5.1)％(P＜0.05);染料木黄酮在0、12.5、25.0、50.0 μmol/L时穿膜细胞数分别为(96.5±5.5)、(88.4±3.2)、(53.8±4.4)、(36.6±3.8)个,可明显降低MG-63细胞的侵袭能力(P＜0.05);染料木黄酮处理后MMP-2及MMP-9的mRNA表达水平明显下降(P＜0.05);MMP-2/MMP-9蛋白表达水平也明显下降,且具有时间依赖性.结论染料木黄酮抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖及侵袭转移能力,这种作用与MMP-2及MMP-9表达变化有关.     

RGDS-GG-KLAKLAKK多肽对人骨肉瘤细胞黏附迁移和侵袭力的影响

目的 研究多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对体外培养人骨肉瘤细胞MG-63黏附迁移和侵袭力的影响,并探讨其作用机制.方法 将不同浓度(0、25、50、75、100μmoL/L)的多肽RGDSGG-KLAKLAKK与MG-63细胞混合培养,用比色法测量多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞黏附力的抑制作用,通过transwell小室侵袭模型检测多肽对MG-63细胞侵袭力的影响.观测多肽对骨肉瘤细胞自发肺转移模型抗肿瘤转移的影响.结果 MG-63骨肉瘤细胞对纤维连接蛋白(Fn)的黏附被多肽GDS-GG-KLAKLAKK对明显抑制(P<0.05).25、50、75、100 μmol/L的多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞侵袭力的抑制率分别为(18.3±2.9)%、(28.5±4.8)%、(40.4±5.6)%和(66.7±7.8)%,对比空白对照组(0μmol/L多肽)差异有统计学意义(P<0.05).多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63骨肉瘤细胞浸润能力有明显抑制作用.MG-63骨肉瘤细胞接种于裸鼠后给予多肽RGDS-GG-KLAKLAKK治疗,与对照组比较,有明显的肺重减轻、肺转移灶减少(P<0.05).结论 多肽RGDS-GG-KLAKLAKK能够抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外黏附、侵袭和转移.     

三氧化二砷抗人骨肉瘤细胞株MG-63的实验分析

目的:探讨三氧化二砷(Arsenic Trioxide,As2O3)对人成骨肉瘤细胞株MG-63的抑制作用及机制.方法:将MG-63细胞于37℃,5％ CO2等实验条件下传代培养,等细胞进入对数生长期后再进行操作.采用以下实验方法:MTT检测:将MG-63细胞接种于96孔板,测定As2O3对MG-63细胞的半数抑制浓度(IC50),然后测定药物终浓度分别为0、As2O3的IC50、对MG-63细胞的抑制率.结果:MTT法测定As2O3对MG-63细胞的IC50为2.15μmol/ml,IC50浓度的As2O3MG-63细胞的抑制率分别为(52.20±0.19)％结论:低浓度的As2O3抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡的能力均有明显增强.     

NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响

[目的]观察NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响.[方法]体外培养人骨肉瘤MG -63细胞系,用50,100,200和400 RmoV L的PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24,48,72 h后,用MTT法测各组骨肉瘤MG-63细胞存活率,用流式细胞仪测细胞的凋亡率.用Western Blot方法检测不同浓度PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后,各组细胞的Livin和Caspase-9蛋白的表达水平.[结果]随PDTC浓度增加,骨肉瘤MG-63细胞后其增殖活性呈下降趋势,作用时间越长细胞的增殖活性越低,而细胞的凋亡率呈上升趋势(P<0.05).随PDTC浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达呈下降趋势,而Caspase9蛋白表达呈上升趋势(P<0.05).[结论]PDTC可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与PDTC抑制NF-kB传导通路,下调Livin表达继而上调Caspase-9表达有关.     

硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响

目的 研究硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测bcl-2及bax基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG-63诱导凋亡的作用。结果 硫化砷可明显抑制MG-63细胞的增殖，1．0mg／L浓度的硫化砷作用24h后，MG-63细胞的抑制率可达26．43％。倒置显微镜观察被硫化砷抑制的MG-63细胞呈典型的凋亡改变．流式细胞仪检测凋亡率与硫化砷处理时间、处理浓度呈正相关。在硫化砷的作用下，MG-63细胞的bcl-2表达下调，而bax表达无明显改变．结论 硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl-2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。     

热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

目的观察热疗联合特异性siRNA沉默趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)对骨肉瘤增殖和侵袭的影响。方法培养人骨肉瘤细胞株MG 63至对数生长期,接种于6孔板中,分为三组,空白组细胞不进行任何处理常规培养,control siRNA组以control siRNA转染细胞,CXCR4 siRNA组以CXCR4 siRNA转染细胞,采用Western blot检测各组CXCR4的表达变化,评估CXCR4 siRNA转染效能。细胞及体内实验设置control siRNA组(对照组)、热疗联合CXCR4 siRNA组(联合组)、CXCR4 siRNA组(沉默组)和热疗组,以CXCR4 siRNA转染沉默组和联合组的细胞,control siRNA转染对照组细胞,热疗组和联合组进行热疗处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)和Western blot检测各组细胞CXCR4的表达变化。CCK 8法和Transwell侵袭实验检测转染后MG 63细胞的增殖能力和侵袭能力变化。流式细胞技术检测转染后MG 63细胞的周期变化。体外裸鼠成瘤实验和肿瘤生长曲线观察转染后MG 63细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长情况。结果CXCR4 siRNA可以有效沉默MG 63细胞中CXCR4蛋白的表达。热疗联合CXCR4 siRNA有效沉默MG 63细胞中CXCR4的表达并能抑制MG 63细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期于G0/G1期(P均<0.05)。体内实验结果显示,从第14天起,联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组的瘤重也低于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论热疗联合特异性沉默CXCR4抑制骨肉瘤的增殖和侵袭,可作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。     

反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响

目的: 构建人组织蛋白酶L (cathepsinL, CATL) 基因的正、反义真核表达载体, 观察其转染后对人骨肉瘤细胞MG-63侵袭特性的影响。方法: 用基因重组技术构建人组织蛋白酶L正、反义真核表达载体, 转染人骨肉瘤细胞MG-63, RT-PCR和Westernblot检测CATL的mRNA和蛋白质的表达水平, 并对转染前后骨肉瘤细胞的侵袭能力进行检测。结果: 正、反义真核表达载体成功构建并转染入MG-63细胞中。反义载体转染后的细胞CATL的mRNA和蛋白质的表达水平下降, 体外侵袭实验表明细胞的侵袭力下降。结论: 反义CATL基因的转染使骨肉瘤细胞CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力下降。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。