RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰技术具有高特异性、高效性等显著优势,近年在医学领域广泛应用,包括基因组研究、病毒性疾病治疗、肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗及新药开发等。本文就RNAi技术的研究现状作一综述。     

几种常见性传播疾病的研究现状

目前梅毒、淋病、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、尖锐湿疣是我国常见的几种主要的性传播疾病,现就以上这几种疾病在流行病学、诊断方法、治疗及预防等方面的研究现状及进展进行了介绍。     

端粒酶小干扰RNA技术体外抑制Hut78细胞生长及诱导凋亡的研究

目的探讨针对端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）技术对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞株Hut78端粒酶活性和细胞生长的影响。方法用T7 RNA聚合酶介导的体外转录法合成两对hTERT—siRNA．将合成的siRNA转入Hut78细胞中，用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测Hut78细胞端粒酶活性及hTERT mRNA的表达。用MTT法和流式细胞仪分析细胞增殖及凋亡的变化。结果将合成的siRNA（250ng）转染入Hut78细胞48h后，端粒酶活性被明显抑制，抑制率分别为68％和64％；hTERT mRNA的表达下降。细胞生长抑制作用有明显的剂量依赖性，以1000ng剂量抑制效果最明显。同时观察到细胞凋亡，凋亡率分别为15、86％和11.10％（P〉0．05）。结论体外转录法合成的hTERT-siRNA能明显抑制Hut78细胞端粒酶的活性，降低hTERT基因表达．抑制细胞生长增殖及诱导细胞凋亡。     

外用联合靶向siRNA治疗生殖器疱疹豚鼠模型实验

目的: 评价联合靶向特异性小干扰RNA（HSV-2 UL27.2 和UL29.2 基因）对生殖器疱疹（GH）模型的疗效。方法:（1）病毒攻击实验：雌性豚鼠60只,随机分为治疗组和对照组,每组30只,治疗组小鼠外阴和阴道内外用联合靶向特异性小干扰RNA(CT-siRNA),对照组外用非靶向基因的RNA制剂（siN.C）,作用4小时后给予疱疹病毒2型（HSV-2）野生株接种,观察豚鼠发病情况并计算生存率。（2）选取接种HSV-2后具有初发GH反应的雌性豚鼠60只,分为治疗组和对照组,每组30只,分别外用CT-siRNA和siN.C制剂,每周1次至皮损愈合。2个月后腹腔内注射环磷酰胺并给予紫外线照射诱导复发,计算疱疹复发率及HSV-2培养阳性率。结果:病毒攻击感染后治疗组存活率（80.0%）高于对照组（23.3%）(P＜0.05)。治疗第10天治疗组皮损积分值（0.25±0.25）较对照组明显降低（1.0±1.25）(P＜0.05)。诱导复发后,治疗组复发率（16.7%）低于对照组（60.0%）(P＜0.05).结论: 外用CT-siRNA制剂能预防HSV-2的感染及GH复发。     

性病与婚育

本文阐述了我国常见性病(艾滋病、梅毒、淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣、生殖器疱疹)对生育和结婚的影响，并提供了妊娠合并性病的处理。     

性传播疾病

20120358海南省2004 -2009年梅毒流行趋势分析/陈莉(海南省疾控中心)//现代预防医学.-2011,38(3).-418～419,422收集海南省近年梅毒发病资料,进行描述性流行病学分析.结果:2004 - 2009年梅毒年发病率及其在传染病疾病谱中的比例呈明显上升趋势;海南省梅毒发病地区分布不均衡,高发地区为海口、三亚市;人群分布特征显示,不详、农民、其他、家务待业人群发病较多,占病例总数的64.97％.     

RNA干扰与皮肤恶性肿瘤的治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是在转录水平上的基因阻断技术,可以抑制靶基因表达或使基因沉默。促成针对性的RNAi发生,达到在不同环节上调节恶性肿瘤发生、发展,影响基因的表达,是RNAi参与皮肤恶性肿瘤治疗的重要思路。使用RNAi技术参与肿瘤的治疗具有针对性强、效率高、作用可以持久的优势,可能特异性、长期及完全抑制目的基因表达、逆转肿瘤细胞恶性表型、诱导肿瘤细胞发生调亡和降低肿瘤耐药性,从而实现抑制肿瘤发生、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤侵袭性、逆转肿瘤耐药性,达到治疗肿瘤的目的。     

RNA干扰对系统性硬化病皮肤成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 研究RNA干扰对系统性硬化病(SS)皮肤成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白表达水平的影响.方法 设计4个针对CTGF的特异性小干扰RNA(siRNA)及一个非特异性siRNA.体外转录获得siRNA,将siRNA用6-羧基荧光素(FAM)标记后瞬时转染至原代培养的SS患者皮肤成纤维细胞;转染48h后,以RT-PCR及蛋白印迹法分别检测CTGF mRNA及蛋白量的变化.结果 转染了4个特异性siRNA的成纤维细胞中CTGF mRNA水平均有不同程度下调(P<0.001),抑制效果由强至弱为,siRNA742>siRNA828>siRNA578>siRNA948.蛋白印迹则显示有3个siRNA能使CTGF蛋白表达水平不同程度下调(P<0.001),其中siRNA742的抑制效应最强.结论 RNA干扰能显著抑制SS成纤维细胞CTGF的表达.     

1人同患3种性病

目的:报告1人同患生殖器疱疹、梅毒和尖锐湿疣3种性病1例。患者女,34岁,外阴反复出现小水疱、溃疡、疼痛10余月,复发20天;双足底红斑、脱屑3月;外阴赘生物2周。实验室检查结果示HSV抗原试验阳性,RPR阳性(1:16),TPHA阳性(1:1280),外阴赘生物醋酸白试验呈阳性。     

树突状细胞在性病方面的进展

树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的专职抗原提呈细胞,其抗原提呈能力是巨噬细胞的10￣100倍。它可以有效地刺激T、B淋巴细胞活化,从而将固有免疫和适应性免疫有机联系起来。大量研究表明,树突状细胞在抗肿瘤、抗感染、移植排斥和自身免疫性疾病中发挥重要作用。最近已有关于树突状细胞在艾滋病、梅毒、尖锐湿疣和生殖器疱疹等方面的报道,就树突状细胞在性病方面的研究进展作简要综述。     

iRNA抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达

目的 通过构建生存素(survivin)的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人黑素瘤M14细胞生存素表达的抑制作用,为后续研究奠定基础.方法 设计有小发夹结构的生存素siRNA对应模板DNA序列,克隆至pRNAT-H1.1/neo质粒,构建重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin,转染人黑素瘤M14细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹检测生存素表达.结果 酶切及测序结果 证实重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin构建成功.将重组质粒及空载体(阴性对照)转染M14细胞48 h后,siRNA处理组M14细胞生存素表达较空白对照组显著下降,表达抑制率在mRNA和蛋白水平分别为62.3%±1.5%和53.6%±0.9%.结论 生存素siRNA表达质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin可抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达.     

小干扰RNA抑制2型单纯疱疹病毒作用的研究

目的 研究小干扰RNA（siRNA）在体外抑制2型单纯疱疹病毒（HSV-2）的作用。方法 根据HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因序列设计、合成siRNA。采用病毒产量减少实验测定siRNA对病毒复制的抑制,在预防性作用研究中,24孔板Vero细胞转染siRNA,4 h后换液并接种HSV-2病毒（0.02 ～ 0.05 PFU/细胞）;在治疗性作用研究中,24孔板Vero细胞接种HSV-2,1 h后转染siRNA。荧光定量RT-PCR测定siRNA对病毒靶基因mRNA水平的影响。结果 分别针对HSV-2 VP16基因及DNA聚合酶基因设计的siRNA--VP2-1和DP2-1,在预防性及治疗性作用研究中均能有效抑制病毒复制,使病毒滴度降低约1个log10 。siRNA VP2-1使病毒VP16 mRNA的水平在感染后6 h和12 h分别降低58.6％和79.5％,而siRNA DP2-1使病毒DNA多聚酶的mRNA水平分别降低59.8％和77.4％。结论 HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因的siRNA体外能有效抑制HSV-2复制,VP16和DNA多聚酶基因可以作为RNA干扰抑制HSV病毒复制的靶基因。     

地理信息系统方法在性病艾滋病监测中的应用

地理信息系统具有地理空间分析、空间统计分析、多要素综合分析、精确定位和可视化等优势,已由最初应用于测绘学和环境科学,逐步应用到公共卫生领域.近年已成为性病艾滋病监测的一个重要工具,对确定性病艾滋病疫情空间分布模式、开展聚集性分析、发现疫情核心区、探讨危险因素、追踪传播来源具有独特作用.     

特异性小干扰RNA下调中期因子基因表达对黑素瘤细胞黏附和侵袭的影响

目的 探讨中期因子（midkine, MK）基因小干扰RNA（siRNA）对黑素瘤细胞侵袭的影响。方法 根据MK基因mRNA序列特点,设计并用化学方法合成3个siRNA,转染人黑素瘤A375细胞后,以荧光实时定量PCR方法筛选出效果最好的siRNA,以此siRNA转染人黑素瘤A375细胞。同时设空白对照组（不予任何处理）和空载对照组（仅用脂质体转染）。分别以荧光实时定量PCR和Western印迹方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝法检测细胞黏附率,以Boyden小室模型方法检测细胞侵袭力。结果 所设计的siRNA均能有效下调MK基因mRNA表达水平,以S3号作用最强。以该siRNA转染A375细胞后,荧光实时定量PCR结果显示,转染组A375细胞MK基因mRNA水平明显下降,且呈浓度（24 h时r = -0.906;48 h时r = -0.922;72 h时r = -0.939,P均 < 0.01）和时间（3.125 nmol/L r = -0.889;6.25 nmol/L r = -0.935;12.5 nmol/L r = -0.928,P均 < 0.01）依赖性。细胞黏附试验显示,3.125、6.25和12.5 nmol/L siRNA组黏附率分别为73.66% ± 2.25%、49.36% ± 2.16%和28.35% ± 1.68%,呈浓度依赖性下降（r = -0.936,P < 0.01）。Boyden小室试验结果显示,3.125、6.25和12.5 nmol/L siRNA组穿过滤膜的细胞数分别为23.9 ± 1.6、12.1 ± 1.5、5.6 ± 1.2,而空白对照组为36.8 ± 1.5,穿膜细胞数呈浓度依赖性下降（r = -0.915,P < 0.05）。结论 MK基因在黑素瘤细胞黏附、侵袭中发挥重要作用;以siRNA转染黑素瘤细胞抑制该基因表达可抑制黑素瘤细胞黏附、侵袭能力。     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）沉默肾上腺髓质素（ADM）基因对黑素瘤细胞系A375增殖和凋亡的影响。方法 实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）检测干扰效果,并选出干扰效果最好的siRNA。用筛选出的最有效siRNA转染A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。免疫细胞化学法蛋白水平检测干扰效果;噻唑蓝法（MTT）分别测定沉默ADM基因 24、48 h后A375细胞增殖的变化;流式细胞仪（FCM）检测干扰ADM基因48 h后A375细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR显示ADM-siRNA-2干扰效果最好。免疫细胞化学结果显示转染ADM-siRNA-2后ADM蛋白的表达显著低于未转染组和阴性对照组。MTT结果显示,转染ADM-siRNA-2的细胞24、48 h吸光度A值为0.389 ± 0.0375,0.469 ± 0.0330,低于空白对照组 （ 0.574 ± 0.0733、0.685 ± 0.0154）和阴性对照组（0.548 ± 0.0376、0.676 ± 0.0374）,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。FCM检测显示转染ADM-siRNA-2组的细胞早期凋亡率为（20.200 ± 6.046）%,高于空白对照组（1.667 ± 0.340）%和阴性对照组（4.587 ± 1.294）%,差异有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。结论 siRNA沉默ADM基因对A375增殖有抑制作用;而对凋亡则有明显促进作用。     

p16INK4a与HPV感染相关疾病

p16是抑制CDK4和6的肿瘤抑制蛋白。高危型HPV中的致癌基因E7可使p16^INK4a失去pRb的反馈性抑制而过度表达且功能异常。低危型HPV感染相关的尖锐湿疣中p16^INK4a免疫活性表现为离散、点状分布的阳性。中高危HPV感染相关的鲍恩样丘疹病中p16^INK4a免疫活性表现为弥漫强阳性。p16^INK4a较HPV型别能更客观地推测尖锐湿疣、鲍恩样丘疹病恶变的可能。     

2008—2016年中国性病监测点尖锐湿疣流行特征分析

目的 了解中国尖锐湿疣流行特征,为制定控制对策提供依据.方法 用描述性流行病学方法对2008—2016年中国105个国家性病监测点报告的尖锐湿疣病例资料进行"三间分布"分析.结果 尖锐湿疣的报告发病率从2008年29.47/10万下降到2016年24.26/10万,年均下降2.21%.不同监测点报告发病率差异较大,最高可达207.36/10万,最低<1/10万.高发监测点主要分布于珠江三角洲、长江三角洲、闽江地区和西部部分少数民族地区,报告发病率较低的监测点主要分布在东北、华北和中部地区,少数农村监测点无病例报告.2008—2010年女性报告发病率高于男性,2011—2016年男性高于女性,男女性别比呈上升趋势,由2008年的0.97:1上升至2016年的1.11:1.高发年龄段为20~39岁的性活跃人群,以25~29岁年龄组报告发病率最高(68.78/10万~91.12/10万).综合医院报告病例数最多,占60.44%~79.48%,其次为皮肤性病专科医院、妇科医院和妇幼保健院.结论 中国性病监测点尖锐湿疣发病总体上呈稳中有降趋势,但仍维持在较高水平,一些低发地区监测点仍呈增长趋势,应引起重视,根据其流行特定采取有效的防治措施.