抗人精子膜蛋白iRNA诱导抗体生成及其抗生育实验研究

本文报道抗人精子膜蛋白iRNA致敏小鼠可转移抗精子膜蛋白免疫。以ELISA法检测抗人精子膜蛋白iRNA诱导小鼠体内的抗体活性,检测结果:iRNA组OD值为0.907±0.150;膜抗原组为1.590±0.300;nRNA组为0.136±0.060。FD与SIT试验结果,iRNA组精子凝集和制动抗体阳性各为75%与58.3%,膜抗原组两者皆为100%。小鼠抗生育实验显示,脾iRNA组抗生育率为67%;肝iRNA为28.6%;膜抗原则为56%。我们认为抗人精子膜蛋白iRNA具有明显的抗生育效应。     

人精子膜甘露糖结合蛋白的研究

我们运用 Percoll密度梯度离心技术从正常捐精者的精液中分离出成熟精子并使其获能 ,经含 1 %穿通 (Triton) X 1 1 4Tris缓冲液溶解 ,超声粉碎及离心分离后获得人精子可溶性蛋白悬液。随后运用蛋白质亲和层析及 SDS PAGE电泳技术分离人精子可溶性蛋白质 ,经银染后发现 :用山羊抗人巨噬细胞甘露糖受体 (anti macrophage mannosereceptor,AMMR) Ig G包被的 Affi Prep Hz support珠能结合人精子中一种分子量为2 9KD的蛋白质 ,而对照组为正常山羊血清 (normal goat,NG) Ig G包被珠 ,其结果却呈阴性。最后运用精子膜生物素标记及蔗糖密度梯度离心技术进一步标记分离人精子膜可溶性蛋白质 ,证实了这种与 AMMR Ig G结合的蛋白质为甘露糖结合蛋白 ,存在于人精子膜上。精子膜甘露糖结合蛋白可能与精卵识别的起始过程有相当密切的关系。     

溶脲脲原体与人精子膜蛋白交叉反应抗原的研究

目的 :研究溶脲脲原体 ( Ureaplasma urealyticum,UU)与人精子膜之间的交叉反应抗原。方法 :将从不育患者精液中分离、纯化等获取的 UU蛋白质与人精子膜蛋白进行十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE) ,再将电泳条带转移到硝酸纤维素膜上 ,用兔抗人精子膜抗血清及羊抗兔 Ig G- HRP进行 Western blot反应。结果 :Western blot证实 UU中 61 k D、5 0 k D和 2 7k D蛋白质组份与精子膜蛋白具有相似抗原性。结论 :UU与人精子膜之间存在交叉反应抗原 ,这可能与临床上 UU感染不育患者血清和 /或精液中抗精子抗体 ( As Ab)阳性率明显升高相关     

含编码人精子膜蛋白cDNA的重组沙门氏菌的构建

ＨＳＤ Ｉ是编码人精子膜蛋白（ｈＳＭＰ １）的ｃＤＮＡ,将其中５５０ ｂｐ 的目的ｃＤＮＡ与编码通用终止密码子的Ａｄａｐｔｅｒ相连接,再将该重组ｃＤＮＡ插入到ｐＵＣ１９的多克隆位点,经酶切、测序鉴定后,利用ＥＣｏＲＩ酶切重组质粒,回收插入片段,并将其准确地连接到两种不同拷贝数的ａｓｄ＋ 载体（ｐＹＡ２９２、ｐＹＡ３１３７）中,使其在减毒的Δｃｙａ、Δｃｒｐ、Δａｓｄ 基因缺失的沙门氏菌（χ４５５０）中表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,两种重组沙门氏菌的全细胞裂解液与ｈＳＭＰ １的兔抗血清在２１ ＫＤ处有一明显的结合带。我们成功地构建了表达ＨＳＤＩ（５５０ ｂｐ）的两种重组沙门氏菌,并检测了其体外生长特性。该重组沙门氏菌有望成为一种新的粘膜免疫避孕的疫苗。     

自身抗体对体外受精——胚胎移植结果影响的研究

目的研究自身抗体对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)结果的影响.方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)对2001年9月～2002年8月共164个IVF-ET周期中女性血清中抗心磷脂抗体免疫球蛋白G,M(ACAbIg-G,M)、抗精子抗体(AsAb)和抗卵巢抗体(AOAb)进行测定,同时观察IVF-ET周期妊娠结局.结果 31个ACAb阳性周期中妊娠率为12.90%(4/31),明显低于133个抗体阴性的33.08%(44/133),二者差异有显著性(P＜ 0.05);18个AsAb阳性周期的妊娠率为27.78%(5/18),与146个抗体阴性的周期的妊娠率30.82%(45/146)相比较二者差异无显著性(P＞0.05).在19个AOAb抗体阳性周期中,妊娠率为10.53%(2/19),明显的低于145个抗体阴性周期的31.72%(46/145)(P＜0.05),二者比较差异有显著性.在上述三种抗体中,体内只有一种抗体存在的病人,妊娠率为20.83%(10/48),明显低于无任何抗体存在者的妊娠率36.27%(37/102)(P＜0.05).存在二种抗体者的妊娠率为8.33%(1/12),与前两者相比差异有显著性.而体内存在三种抗体的病人,其妊娠率为0%(0/2).结论女性患者体内ACAb可能干扰了IVF-ET中胚胎着床.AsAb主要影响精子的运输,而对受精卵的着床及发育关系不大.AOAb通过干扰卵裂后的胚胎成熟导致移植失败.     

对-羟基苯甲酸丁酯对人精子顶体蛋白酶的抑制作用及其对精子膜功能的影响

本文用明胶玻片法研究对-羟基苯甲酸丁酯对人类精子顶体蛋白酶水解活性的抑制作用,较典型的顶体蛋白酶抑制剂TLCK 的抑制活性强20倍。应用精子尾低渗膨胀实验方法和曙红染色方法,还证明了对-羟基苯甲酸丁酯对精子膜功能有破坏作用;用不同浓度的对-羟基苯甲酸丁酯处理精子1min 后,精子尾低渗膨胀百分率与存活精子百分率具有很好的正相关性(r=0.92)。这说明此化合物的杀精子作用可能是由于对精子膜功能的损伤所致。由于这种化合物能够强烈地抑制人类精子顶体蛋白酶的蛋白水解活性。并对精子膜功能产生不可逆转的损伤,所以很有希望开发成为新型的阴道避孕药。     

溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响

目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响。方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增UreG全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中。在E.coliBL21中,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达His融合蛋白。用亲和层析纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取多克隆抗体。观察该抗体对小鼠体外受精的影响。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA检测证实,免疫小鼠产生了高效价的抗体。该抗体能够抑制小鼠精卵的融合。结论:与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体,可导致小鼠精卵结合率降低。     

不同剂量HCG对体外受精-胚胎移植的影响

目的 :比较使用不同剂量人绒毛膜促性腺激素 (HCG)对体外受精 /胞浆内单精子注射 (IVF/ICSI)的结局及对卵巢过度刺激综合征 (OHSS)发病率的影响。方法 :对在本所接受IVF/ICSI辅助生育的 2 6 2例采用GnRH a长方案促排卵的患者进行回顾性分析 ,按HCG用量分为A组 (HCG 5 0 0 0～ 6 0 0 0U)、B组 (HCG 80 0 0～ 10 0 0 0U)。结果 :两组临床妊娠率分别为 35 .94 %和 38.0 5 % (P >0 .0 5 ) ,OHSS发生率分别为 2 .34%和 4 .4 8% (P >0 .0 5 )。结论 :减少HCG用量后对IVF/ICSI的临床妊娠率无明显影响 ,且可以减少OHSS的发生。     

白细胞介素对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响

本文就人白细胞介素（ＩＬ－１β、５、６）对小鼠的体外受精率、体外受精卵的发育率，以及从交配雌鼠体内回收的２细胞期胚（体内受精卵）的发育率带来的影响进行了探讨。ＩＬ－１β５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－５５ｎｇ－ｍｌ以上、ＩＬ－６０．５ｎｇ／ｍｌ以上时对小鼠的体外受精率有明显抑制（Ｐ＜０．０５）。体外受精卵序的发育仅ＩＬ－６实验组见到抑制，０．５ｎｇ／ｍｌ以上对４细胞期胚发育有抑制，５０ｎｇ／ｍｌ时对８细胞期胚到囊胚期的发育有抑制。对体内受精卵的发育ＩＬ－１β和ＩＬ－６实验组与对照组间均未见到差异，但ＩＬ－５对囊胚期的发育有促进。以上结果提示，子宫内膜异位症时，人腹腔液中存在的ＩＬ－１β、５、６由于其抑制受精率而造成不孕。     

人精子膜上凝集素受体的研究

从糖专一性相同或不同的24种凝集素中筛选出SML、MDL、CKL和PHA-S四种能与人精子发生强烈反应的凝集素,浓度为0.98μg/ml时就能使精子凝集成块,6 h后,凝集团块也不分散,用机械方法分散团块所得精子已完全失去活动能力;其凝集作用可被凝集素各自的抑制糖所抑制;用FITC标记的SML、CKL、MDL与正常人精子作用后,在荧光显微镜下可观察到各凝集素受体的分布部位各不相同;用去垢剂增溶精子,Brij 58的增溶效果最好,增溶的膜蛋白可强烈地抑制凝集素对兔红细胞的凝集作用。     

抗精子单克隆抗体抑制小鼠体外受精

抗人精子单克隆抗体YWKⅠ和YWK-Ⅱ及抗兔精子单克隆抗体rSMP-B均能显著抑制人精子穿入去透明带金黄地鼠卵。在本文的小鼠体外受精实验中,获能精子先与10倍稀释的抗精子单克隆抗体作用10min后再与卵子混合。结果表明:三种抗精子单克隆抗体对小鼠体外受精均有明显的抑制,其中YWM-Ⅰ使受精率下降至16.9%。此外还发现YWK-Ⅱ及rSMP-B主要抑制小鼠精子穿入透明带,而YWK-Ⅰ除此之外还抑制穿入透明带后的精子进一步完成受精。     

The Effects of Brief Gamete Co-incubation in Human In Vitro Fertilization

Purpose: To investigate whether very short exposure ofmature oocytes to sperm in vitro may affect the fertilizationrates, embryo cleavage rates, and embryo quality betweensibling oocytes in the same patient. Methods: Sibling oocytes of the same patient from 23 oocytecollection cycles were randomly allocated to the study group,with a 1-hr or 3-hr sperm—oocyte incubation, or the controlgroup with the standard overnight gamete co-incubation.The fertilization rates, cleavage rates, and subsequentembryo quality were evaluated. Results: Our results showed no statistically significant differencesin fertilization rates, embryo cleavage rates, andquality of the embryos between the study group and thecontrol group. Conclusions: Since the present study showed that long exposureof the oocyte to sperm has no advantage over shortexposure, we prefer shortening the oocyte—sperm incubationperiod for reducing the negative effect induced bynonphysiologically high concentrations of spermatozoa.     

ANDROLOGY: Relation Between Different Human Sperm Nuclear Maturity Tests and In Vitro Fertilization

Purpose: To consider the relationship between different sperm nuclear maturity tests and in vitro fertilization (IVF) rate, in order to select the most sensitive, specific, and independent factor(s) for prediction of in vitro fertilization.Methods: Infertile couples (101) were randomly selected from IVF candidates referred to Isfahan Fertility and Infertility center. Semen samples were collected on the day of oocyte recovery. Following routine semen analysis, major portion of the semen was prepared for routine IVF insemination and the remaining was used for following sperm nuclear maturity tests: chromomycin A3 (CMA3), aniline blue, sodium dodecyl sulphate (SDS) test, and acridine orange test with or without heat shock (87°C, 5 min). Sperms (200) were evaluated for each test. The results were recorded and analyzed for their correlation to fertilization rate, using correlation coefficient, logistic regression analysis, student t-test, and receiver operating characteristics (ROC) curve.Results: Among these tests, aniline blue and CMA3, and semen parameters, sperm morphology, and sperm motility showed a significant correlation with fertilization rate. Using logistic regression analysis, sperm morphology and CMA3 were the only independent factors related to in vitro fertilization. ROC curves showed that among above tests, CMA3 is the most specific and sensitive for sperm nuclear maturity.Conclusion: Among CMA3, aniline blue, SDS test, and acridine orange, CMA3 was the most sensitive and specific test that can be used along with routine semen analysis for more precise prediction of fertilization rate.     

Late Fertilization of Unfertilized Human Oocytes in In Vitro Fertilization and Intracytoplasmic Sperm Injection Cycles: Conventional Insemination versus ICSI

Purpose: The aim of this study was to evaluate the efficacyof intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in comparisonwith conventional reinsemination using fertilization failedoocytes by conventional in vitro fertilization (IVF). Methods: Oocytes were collected from patients of IVF orICSI cycles. Patients were grouped by fertilizationtechniques: group 1: conventional IVF; group 2: reinseminationafter conventional IVF failure; group 3: regular ICSI; group4: 1-day-old ICSI after conventional IVF failure; group 5:2-day-old ICSI after conventional IVF failure; group 6:re-ICSI after regular ICSI failure. Results: In different insemination groups, normalfertilization rate was higher (P < 0.001) in 1-day-old ICSI (47.1%)and 2-day-old ICSI groups (40.0%) than in reinsemination(14.7%). Abnormal fertilization rate was higher (P < 0.05)in re-ICSI group (21.7%) than any other groups (range:0–8%). Cleavage rate was higher in 1-day-old (36.7%)and 2-day-old ICSI groups (36.0%) than in reinsemination(5.3%, P < 0.001) or re-ICSI groups (17.4%, P < 0.05).Pregnancy rate was 27.6% and 20.0% in conventional IVFand regular ICSI groups, respectively. However, 1-day-oldICSI (group 4) and 2-day-old ICSI (group 5) were attemptedonce embryo transfer (ET) but failed pregnancy occurredin each group. Conclusions: In fertilization failure cycles, late ICSIincreases the rate of fertilization and embryonic developmentand may rescue the completely failed attempt of pregnancy.     

链状酰胺类化合物B07的体外杀精效果及其对精子质膜的影响

目的:研究一种链状酰胺类化合物(B07)的体外杀精作用及其对精子质膜的影响。方法:上游收集高活力人类精子分别与0μg/ml(对照组),5~640μg/ml B07作用30 min,随后用计算机辅助精液分析仪分析记录精子的活率及运动参数;用160μg/ml B07与精子作用,记录5 min、30 min、60 min和120 min时精子活动率;处理后的精子一部分经SYBR-14/PI双染后用荧光显微镜观察,另一部分通过电子显微镜来观察质膜的变化情况;并以壬苯醇醚(N9)作为阳性对照。结果:随着B07浓度的升高,精子活率和活力呈下降趋势,最低有效浓度(MEC)为640μg/ml;荧光显微镜下经B07处理的精子呈橙色,而N9处理的精子呈红色;电子显微镜显示B07组精子头部肿胀起泡,尾部针孔样损伤,N9组精子呈溶解性改变。结论:B07具有体外杀精作用,且该作用有时间和浓度依赖性,且其对精子质膜的影响小于N9。     

腺苷脱氨酶活性对人精子运动的影响

本研究发现人精子膜中有腺苷脱氨酶(ADA)活性,其Km值为266.94±1.31μM。比牛附睾尾部精子膜中ADA的Km高一个数量级。我们发现活力低于50%的不育者精子膜中的ADA活性(154.22±88.49 μM/mg/h,14例)明显高于正常人精子膜中的ADA活性(67.45±17.66μM/mg/h,25例),p<0.01。用ADA的特异性抑制物erythro-9-(2-hydroxy 1-3-nonyl)adenine(EHNA)处理洗过的正常人精子6 h后,实验组精子活力(91%)明显高于对照组(0%),p<0.01;同样条件下测得34例不育者精子的活力(83.86±11.21%)明显高于对照组(68.27±18.73%),p<0.01。另外EH NA处理后的精子,其穿透去透明带金黄地鼠卵的能力均有升高,正常人精子从54±8.66%升高到83±6.69%,不育者精子从21.33±55%升高到77±9.67%,p<0.01。上述结果表明精子膜上的ADA活性对精子的生理功能有影响     

精子核碱性蛋白转化与精子畸形及不明原因流产关系初探

本文探讨了精子核碱性蛋白转化与精子畸形及不明原因流产的关系。对８例有二次以上不明原因早期流产妇女的配偶（流产组）及１０个正常生育力的男性（对照组）作精子形态学检查，抽提精子核碱性蛋白，在酸－尿素聚丙烯酰胺凝胶（ａｃｉｄ－ｕｒｅａＰＡＧＥ）中电泳，测定组蛋白（Ｈ），中间型碱性蛋白（ＩＢＰ）及鱼精蛋白（ＨＰ１～３）各区带的相对含量，以（ＨＰ１～３）占总碱性蛋白（ＴＢＰ）的百分比表示碱性蛋白转化率。实验结果为：（１）碱性蛋白转化率与精子畸形率成直线负相关关系（ｒ＝－０．７５９Ｐ＜０．０１）；（２）流产组精子核碱性蛋白转化率低于对照组（Ｐ＜０．０５），ＩＢＰ／ＴＢＰ则高于对照组（Ｐ＜０．０５）。提示精子核碱性蛋白转化障碍致中间型碱性蛋白（ＩＢＰ）及组蛋白（Ｈ）在精子染色质中残留过多，是引起精子头部畸形的原因之一，且与不明原因流产有关。     

含编码人精子膜多肽cDNA和乙肝表面抗原基因的重组痘苗病毒

合成编码一种人精子膜蛋白YWK-Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核苷酸链,HSD-2a.将HSD-2a和3’端乙肝表面抗原主S基因连接并与pUC18质粒重组.经鉴定的重组质粒用BamH Ⅰ和EcoRl酶切后,可分离纯化得到HSD-2a和HBsAg的主S基因连接片段,将该连接片段插入痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的痘苗病毒启动子P_(7.5)下游,构建成重组质粒pGJP-HSD/HBs.将该重组质粒传染已感染了天坛痘苗病毒的猴肾细胞CV-1,pGJP-5中含有的TK基因与出发株病毒基因组的TK基因发生体内同源重组,构成重组痘苗病毒vv-HSD/HBs.HuTK~-细胞经vv-HSD/HBs感染后,在5-溴脱氧尿苷存在下进行空斑分析,筛选出TK~-重组病毒.应用ELISA方法对已感染了重组病毒的HuTK~-细胞培养上清和细胞裂解液测定,表明有HSD-2a编码的多肽片段的表达.Western-blot法分析呈现28和30Kd两条显色带.重组痘苗病毒vv-HSD/HBs有可能作为抗生育疫苗用途.