树突状细胞-结直肠癌细胞融合疫苗的制备及生物学特性的研究

目的：研究树突状细胞（DC）与结直肠癌（Lovo）细胞融合疫苗的制备及其生物学特性。方法：①应用PEG融合技术融合树突状细胞和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过描记细胞生长曲线、倒置显微镜和激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测观察细胞生物学特性。③通过检测疫苗的克隆形成率、促进T淋巴细胞增殖能力和疫苗的成瘤活性来观察疫苗的安全性和免疫学效应。结果：融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的形态结构特点，CD80、CD83、CD86等在融合细胞表面的表达较单纯DC显著丰富；融合细胞不出现明显的细胞倍增；融合疫苗在软琼脂上培养21d，未见明显的细胞克隆形成；通过^3H—TdR掺人法检测融合细胞刺激T淋巴细胞增殖情况，发现融合疫苗可强烈刺激T淋巴细胞增殖；融合疫苗接种于裸鼠体内观察30d，未见肿瘤组织生长。结论：融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；融合疫苗可明显促进T淋巴细胞的增殖能力说明将其作为抗结直肠癌特异性免疫治疗方法有进一步研究的意义。     

三阴乳腺癌细胞-树突状细胞融合疫苗的抗肿瘤免疫效应

目的利用细胞电融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其特异性抗肿瘤免疫效应。方法从健康人外周血中分离培养DC,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合;荧光显微镜观察融合疫苗的形态;流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定;ELISA试剂盒检测IL-12、IFN-γ的分泌情况;CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖和细胞毒性效应。结果成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD83、CD11c、CD86、HLA-DR;融合疫苗形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子;T淋巴细胞增殖实验证明融合疫苗有很强的免疫刺激活性;细胞毒性实验证明融合疫苗具有比对照组更强的杀伤肿瘤细胞作用。结论电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强抗肿瘤免疫效应。     

TGF-β_1受体阻滞剂对树突状细胞融合疫苗制备的影响研究

目的探讨TGF-β1受体阻滞剂SB-431542对树突状细胞(DC)融合疫苗制备的影响。方法①SB-431542(TGF-β1受体阻滞剂)与粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)联合应用,刺激C57BL/6小鼠骨髓来源DC成熟,应用聚乙二醇(PEG)融合技术融合DC和小鼠胰腺癌细胞(Panc02),制备融合疫苗。②观察细胞形态、细胞表面表达、MTT法检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。结果①在SB-431542参与下,成熟DC的细胞数目及形态无显著改变;②DC表面CD80、CD86、CD40的表达较未加SB-431542显著增高;MTT比色法,添加SB-431542的DC疫苗组对肿瘤细胞的杀伤抑制率显著提高。结论 SB-431542组融合细胞的分子表达较非SB-431542组显著提高;体外MTT显示SB-431542组有更好的抗肿瘤效应,说明SB-431542对增强融合疫苗抗肿瘤效应有明显的增强作用。     

树突状细胞诱导抗卵巢癌免疫抑制裸鼠SKOV3移植瘤生长并预防其发生

目的：研究树突状细胞（DC）体外诱导抗肿瘤免疫能否预防裸鼠移植瘤发生及抑制裸鼠移植瘤生长。方法：以粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白介素－4（IL－4）刺激卵巢癌患外周血DC；以人卵巢癌细胞系SKOV3细胞粗提物刺激DC；DC激活同源混合T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T细胞（CTL）；CTL预防性接种于裸鼠皮下，观察进一步接种的SKOV3移植瘤发生；观察CTL抑制已接种于裸鼠的SKOV3移植瘤生长。结果：DC诱导的CTL不仅能抑制裸鼠人卵巢SKOV3移植瘤生长，而且能预防该移植瘤发生。结论：肿瘤抗原激活的DC作为一个概念上的抗肿瘤疫苗有可能在卵巢癌的预防及治疗中发挥重要作用。     

SOCS1受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞（BMDC），体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原，并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸（AS1）处理DC，制备负载肝癌抗原DC疫苗；流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度；通过体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下，疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高（P〈0．01），能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力（P〈0．01）。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度，并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

树突状细胞疫苗对大鼠Walker-256肿瘤抑制作用

目的建立Walker-256大鼠种植瘤模型，探讨树突状细胞（DC）疫苗抑制肿瘤生长的机制。方法从大鼠骨髓细胞中利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）在体外定向诱导分化出DC，液氮冻融法提取Walker-256肿瘤细胞抗原后刺激DC制备负载抗原的DC疫苗。ELISA法检测培养液中IL-12的浓度。雌性SD大鼠，皮下注射Walker-256肿瘤细胞制备种植瘤模型，成瘤大鼠按照体重配对，分为肿瘤治疗组和肿瘤对照组。10只体重分别相对应的雌性SD大鼠作为正常对照组。肿瘤治疗组大鼠皮下注射负载抗原的DC细胞悬液，肿瘤对照组和正常对照组大鼠皮下注射等量PBS。分别检测大鼠血IL-12浓度和肿瘤最大径。结果得到大量具备典型光镜和电镜形态特征的DC，表达大鼠DC特异性标志OX62、OX6。负载抗原前后DC产生IL-12的水平存在明显差异（P〈0．05）。肿瘤治疗组大鼠肿瘤最大径显著小于肿瘤对照组（P〈0．01）。肿瘤对照组与正常对照组比较，IL-12明显下降（P〈0．05），肿瘤治疗组与肿瘤对照组比较，IL-12明显上升（P〈0．01）。肿瘤治疗组的肿瘤最大径与IL-12呈显著负相关（r=-0．826，P〈0．01）。结论增强Th1介导的抗肿瘤细胞免疫可能是树突状细胞疫苗抑制肿瘤生长的机制之一。     

沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

目的 改进体外诱导脐血树突状细胞（DC）成熟的方案，为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法 分离脐血单个核细胞（CBMC）并在含10％同源脐血浆、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）的培养体系中诱导培养，部分加入肿瘤冻融抗原和／或沙培林（OK-432）冲击，光镜和电镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中，细胞形态发生明显变化，呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC，细胞表面均高度表达CD1a和CD83，与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义，肿瘤冻融抗原冲击后，DC表面CD1a和CD83的表达上调，沙培林进一步刺激后，CD1a和CD83表达率显著升高。结论 诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。     

HPV16E6基因树突状细胞疫苗的体内抗宫颈癌研究

目的：研究HPV16E6基因人脐带血CD34＋造血干细胞来源的树突状细胞（DC）疫苗在SCID小鼠体内对人宫颈癌细胞的免疫治疗和保护效应。方法：从人脐带血分离单个核细胞中提取CD34＋干细胞,并诱导其向DC分化;采用阳离子脂质体DMRIE-C将HPV16E6基因介导进入DC,制备其疫苗。在SCID小鼠体内观察DC疫苗的体内致瘤情况及经其致敏的淋巴细胞对人宫颈癌细胞的免疫治疗和保护作用。结果：人脐带血来源CD34＋干细胞能诱导出成熟及有功能的DC;体内抗肿瘤研究,经DC疫苗致敏的T淋巴细胞治疗荷瘤小鼠,肿瘤生长速度、瘤体积和重量明显小于未致敏T淋巴细胞治疗的荷瘤小鼠（P〈0.01）。用经DC疫苗致敏的人外周血T淋巴细胞预免疫SCID小鼠,受宫颈癌细胞攻击后,与未致敏的T淋巴细胞预免疫组比,肿瘤潜伏期延长（P〈0.01）,体积减小,重量减轻（P〈0.01）。结论：HPV16E6基因人脐带血CD34＋造血干细胞来源的DC疫苗在一定程度上能抑制宫颈癌细胞生长,对其攻击有一定抵御作用,对机体具有抗肿瘤免疫治疗和保护作用。     

DC-OVA疫苗在裸鼠体内的抗肿瘤效应

目的 构建靶向树突状细胞(dendritic cell, DC)的肿瘤疫苗DC-OVA系统,探讨DC-OVA肿瘤疫苗在祼鼠体内的抗肿瘤效应及相关机制。方法 构建表达肿瘤抗原OVA的树突状细胞。建立携带OVA的Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell-OVA, LLC-OVA)的皮下荷瘤裸鼠模型,瘤旁注射DC-OVA疫苗,通过记录肿瘤大小观察肿瘤生长抑制状况。以IHC方法观察肿瘤组织CD3、Nestin、CD133阳性细胞;观察脾DC相关分子(CD11c、OVA)的阳性表达以及T细胞(CD3⁺)的分布、数量和功能变化。同时,应用ELISA方法检测血清中IL-12的表达水平。结果 DC-OVA疫苗预防组与PBS对照组比较,呈现出明显的肿瘤生长抑制(P＜0.05)。与对照组相比,DC-OVA疫苗治疗组肿瘤明显缩小(P＜0.001)。疫苗治疗3次组与治疗1次组比较,效果更明显(P＜0.05)。于实验第4周,疫苗治疗1次组与对照组比较,CD3阳性表达高,Nestin、CD133阳性表达低(P＜0.05);治疗1次组血清IL-12含量较对照组升高(P＜0.001);第8周,治疗1次组血清IL-12含量较第4周治疗组及第8周对照组低。结论 DC-OVA疫苗特异性杀伤了LLC-OVA肿瘤细胞,使肿瘤干细胞表达Nestin、CD133减少。     

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的 研究以CpG作为免疫佐剂,应用黏蛋白1（MUC1）致敏树突状细胞（DC）制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法 健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞（PBMC）,应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用CpG作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤靶细胞以5：1、10：1、20：1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4％,CD86⁺细胞占72.0％,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+CpG+MUC1组明显高于MUC1+DC或CpG+DC组,差异有统计学意义（P<0.01）。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论 经CpG和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。     

IL2－GMCSF融合蛋白高效表达条件的初步研究

已构建好的白细胞介素２－粒／巨噬细胞集落刺激因子（ＩＬ２－ＧＭＣＳＦ）融合基因载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α，进行热诱导表达条件的研究。工程菌在３０℃培养活化至ＯＤ６００ｎｍ＝０．５±０．１时，融合蛋白的表达率最为稳定；而后转为４２℃热诱导４±０．５ｈ，蛋白表达效率最高。     

Mast Quadrant-assisted Minimally Invasive Modified Transforaminal Lumbar Interbody Fusion: Single Incision Versus Double Incision

Background:

The concept of minimally invasive techniques is to make every effort to reduce tissue damage. Certainly, reducing skin incision is an important part of these techniques. This study aimed to investigate the clinical feasibility of Mast Quadrant-assisted modified transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) with a small single posterior median incision.

Methods:

During the period of March 2011 to March 2012, 34 patients with single-segment degenerative lumbar disease underwent the minimally invasive modified TLIF assisted by Mast Quadrant with a small single posterior median incision (single incision group). The cases in this group were compared to 37 patients with single-segment degenerative lumbar disease in the double incision group. The perioperative conditions of patients in these two groups were statistically analyzed and compared. The Oswestry Disability Index (ODI) scores, Visual Analog Scale (VAS) scores, and sacrospinalis muscle damage evaluation indicators before operation and 3, 12 months postoperation were compared.

Results:

A total of 31 and 35 cases in the single incision and double incision groups, respectively, completed at least 12 months of systemic follow-up. The differences in perioperative conditions between the two groups were not statistically significant. The incision length of the single incision group was significantly shorter than that of the double incision group (P < 0.01). The ODI and VAS scores of patients in both groups improved significantly at 3 and 12 months postoperation. However, these two indicators at 3 and 12 months postoperation and the sacrospinalis muscle damage evaluation indicators at 3 months postoperation did not differ significantly between the two groups (P ≥ 0.05).

Conclusions:

Mast Quadrant-assisted modified TLIF with a small single posterior median incision has excellent clinical feasibility compared to minimally invasive TLIF with a double paramedian incision.     

可吸收颈椎椎间融合器对颈椎稳定性影响的对比性研究

目的：考察不同材料、不同形状的颈椎融合器的生物力学特性，并比较融合器的运动稳定性，融合器的形状，材料对颈椎稳定性的影响，以及融合器下沉的影响。方法：采集10具新鲜尸体颈椎标本，制作成颈椎融合标本，采用实验应力分析方法，分别测试不同颈椎椎间融合器椎间融合的生物力学特性。结果：（1）4种颈椎融合器，自体髂骨植入后，颈椎的稳定性最好，钛合金Cage稳定性较差，可吸收椎间融合器，同种异体皮质骨融合器稳定性适中；（2）循环载荷作用下，下沉位移以自体髂骨最小，可吸收椎间融合器，同种异体皮质骨融合器下沉不大，钛合金Cage下沉最大（P＜0．05），结论：可吸收椎间融合器运动稳定性高，下沉位移小，是理想的颈椎椎间融合器。     

退变性腰椎滑脱症手术及术后康复的体会

目的探讨退变性腰椎滑脱手术及术后的康复治疗。方法应用经后路减压加椎弓根内固定植骨融合术，治疗退变性腰椎滑脱30例，术后按康复计划进行治疗。结果术后23例滑脱完全复位，7例滑脱无明显复位，但患音症状亦有明显改善。30例经6个月～24个月随访，治疗改善率为87％，无椎弓根钉断裂及滑脱加重。结论该方法效果满意，术中重点在减压和融合，术后有计划的康复有利于功能早日恢复。     

谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素融合蛋白表达载体的构建

目的　构建谷胱甘肽S转移酶 -血管生成抑制素 (GST -Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法　把血管生成抑制素 (Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX - 2T的多克隆位点上 ,转化大肠杆菌DH5α ,提取质粒DNA ,限制性内切酶消化DNA ,琼脂糖凝胶电泳。结果　经限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ酶切质粒DNA ,电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX - 2T中。结论　成功构建GST -Angiostatin融合蛋白表达载体 ,为获得较大量的基因工程Angiostatin产品 ,为肿瘤治疗研究作必要准备。     

可溶性HVEM-Ig融合蛋白的真核表达、鉴定、纯化及生物学活性检测

目的:构建含鼠疱疹病毒侵入介质（herpesvirus entry mediator,HVEM）胞外区和IgG2a Fc段重组表达质粒,真核表达HVEM-Ig融合蛋白,鉴定、纯化,并检测其生物学活性。方法:通过RT-PCR从BALB/c小鼠脾细胞总RNA中扩增HVEM胞外区片段,WT-1杂交瘤细胞总RNA中扩增鼠IgG2a Fc片段,克隆入真核分泌型表达载体pSecTag2A,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,表达产物用rProtein A凝胶进行亲和层析纯化,获得目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western印迹分析。在单向混合淋巴细胞反应中加入不同浓度的HVEM-Ig融合蛋白作为处理组,同时以加入IgG蛋白的作为阴性对照和未处理的混合淋巴细胞作为空白对照,分别采用\[3H\]-TdR掺入法和ELISA法观察淋巴细胞增殖程度和细胞因子分泌情况。结果:成功构建重组质粒pSecTag2A-HVEM-Ig,表达及纯化HVEM-Ig融合蛋白,并对蛋白的理化性质进行了鉴定。\[3H\]-TdR掺入法和ELISA法结果显示：与对照组相比,该融合蛋白呈剂量依赖性抑制淋巴细胞增殖和IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的分泌(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建了HVEM-Ig融合蛋白真核表达体系,融合蛋白具有预期的抑制淋巴细胞活性及细胞因子分泌的功能,为后续研究该分子在自身免疫和移植免疫反应中的机制奠定了基础。     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

退变性腰椎滑脱症手术及术后康复的体会

目的探讨退变性腰椎滑脱手术及术后的康复治疗。方法应用经后路减压加椎弓根内固定植骨融合术,治疗退变性腰椎滑脱30例,术后按康复计划进行治疗。结果术后23例滑脱完全复位,7例滑脱无明显复位,但患者症状亦有明显改善。30例经6个月￣24个月随访,治疗改善率为87%,无椎弓根钉断裂及滑脱加重。结论该方法效果满意,术中重点在减压和融合,术后有计划的康复有利于功能早日恢复。     

重组蛋白F3T7的亚克隆、表达、纯化及生物学活性的初步鉴定

目的:克隆编码F3T7的DNA序列,获得融合蛋白F3T7,研究其F3T7的功能.方法:采用亚克隆技术获得原核表达载体PET32a( )-F3TwM法测定F3T7的抗血管活性.结果:F3T7具有特异结合血管内皮细胞能力,并抑制其增殖和新血管生成.结论:初步表明F3T7仍具特异结合血管内皮细胞,抑制新血管生长的能力.     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。