同种异体NK细胞对AML细胞体外杀伤活性及初步机制

目的探讨同种异体自然杀伤细胞(NK细胞)对急性髓系白血病(AML)细胞株KG1a的杀伤活性及其分子机制。方法以NK敏感的K562细胞株为对照,免疫磁珠法分离5例健康志愿者NK细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定在不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性,并用流式细胞仪检测KG1a细胞表面人类白细胞抗原I(HLA-I)类分子和NKG2D的配体主要组织相容性复合体(MIC)A/B、ULBP1-3的表达情况。结果效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时NK细胞杀伤K562和KG1a细胞的活性不同,NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性较K562细胞明显减低(P<0.01);K562细胞低表达HLA-I类分子,高表达NKG2D配体MIC可溶性Ⅰ类分子相关蛋白A(MICA)、MICA有亲源性的蛋白(MICB)、ULBP1、ULBP2、ULBP3,而KG1a细胞高表达HLA-I类分子,低表达NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。结论同种异体NK细胞对AML细胞株KG1a的杀伤率低于K562细胞;其杀伤率不同的分子基础与其分子表面配体表达差异和HLA-I分子表达率不同有关。     

姜黄素提高白血病KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性及其分子机制探讨

目的：研究姜黄素作用前后白血病KG1a细胞对同种异体自然杀伤（NK）细胞杀伤的敏感性变化,并初步探讨其分子机制。方法：以对同种异体NK细胞杀伤高度敏感的白血病K562细胞为对照,乳酸脱氢酶释放法检测KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体（MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3）和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达,逆转录PCR法检测细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因mRNA的表达水平。CCK-8法检测姜黄素对KG1a细胞半数抑制量（IC50）,以此含量作用KG1a细胞,再次乳酸脱氢酶释放法检测姜黄素作用后的KG1a对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测姜黄素作用后的KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达水平。结果：与K562细胞比较,KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤呈低度敏感,KG1a细胞表面NKG2D各配体蛋白表达阳性率均明显低于K562细胞（P〈0.01）,HLA-Ⅰ蛋白表达阳性率则明显高于K562细胞（P〈0.01）;在mRNA水平两种白血病细胞表面均有NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因表达。当效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时,姜黄素作用后NK细胞对KG1a细胞杀伤率明显高于作用前（P〈0.01）;作用后KG1a细胞各NKG2D配体表达率均明显升高（P〈0.05或0.01）,HLA-Ⅰ类分子无明显变化（P〉0.05）。结论：姜黄素能提高KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与姜黄素提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关。     

肿瘤患者自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D的表达

目的通过研究肿瘤患者外周血自然杀伤（NK）细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况,探讨二者表达失衡与肿瘤免疫逃逸的关系。方法采用流式细胞术检测40例肿瘤患者和10名正常对照者外周血NK细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况。用全自动五分类血液分析仪测定各病例的血常规。结果肿瘤患者和正常对照组白细胞数值差异无统计学意义;肿瘤患者淋巴细胞比率低于对照组,而NK细胞明显高于对照组;肿瘤患者NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2D均明显高于对照组,但肿瘤患者NKG2D荧光强度呈降低趋势。结论肿瘤患者NK细胞表面NKG2A／NKG2D表达失衡,可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。     

NKG2D介导正常人NK细胞对白血病细胞的杀伤作用

目的 探讨诱导白血病细胞NK细胞表面活性受体(NKG2D)配体表达增加,增强NKG2D与其配体相互作用介导的NK细胞对白血病细胞杀伤活性.方法 用羟基脲处理慢性髓性白血病细胞系OUN-1及白血病患者原代白血病细胞24 h,用流式细胞术检测培养前后其表面NKG2D配体的表达水平.取正常人外周血分离NK细胞并在含IL-2的培养液中培养72 h作为效应细胞,用羟基尿培养前后的OUN-1细胞作为靶细胞,用51Cr释放实验检测NK细胞对OUN-1 细胞的杀伤作用.结果 用羟基脲处理后的OUN-1细胞表面NKG2D配体MIC A/B 和ULBP2表达[平均荧光强度(MFI)值分别为23.5±3.4和33.5±4.8]较未处理的OUN-1细胞(MFI值分别为8.9±0.9和14.5±0.6)明显增加(P\%值分别为0.01和0.03),而ULBP1和ULBP3的表达无明显变化.羟基脲亦能诱导白血病患者原代白血病细胞表面NKG2D配体表达增加.正常人NK细胞对羟基尿处理过的OUN-1细胞杀伤作用明显增强[杀伤率为(62.0±5.6)%对(76.0±5.3)%,P\%=0.02],这种杀伤作用可以被抗NKG2D抗体部分抑制[(76.0±5.3)%对(46.0±4.5)%,P\%=0.00].结论 羟基脲可以诱导白血病细胞系OUN-1细胞表面NKG2D配体表达增加,从而增强NKG2D和其配体的相互作用介导的NK细胞对白血病细胞杀伤作用.     

NKG2D受体配体系统在白血病免疫监视及免疫逃逸中的作用

近年来研究发现NKG2D受体配体的相互作用在白血病免疫中具有一定作用.白血病细胞上表达NKG2D配体有利于NK细胞、CD8+细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)等免疫效应细胞的杀伤,但是白血病细胞自身又能通过一系列的机制逃逸免疫监视.本文就NKG2D受体配体系统在白血病免疫监视及免疫逃逸中的作用作一综述.     

NKG2D在NK细胞杀伤血液肿瘤细胞中的作用

本研究旨在探讨NKG2D在NK细胞杀伤血液肿瘤细胞时是否发挥作用。将多种血液肿瘤细胞株作为靶细胞,并在靶细胞中检测NKG2D相应配体的表达,而后进行杀伤实验。将靶细胞与羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)共孵育,同时将NK细胞系NK92MI分别与NKG2D特异性封闭抗体或同型对照抗体共孵育。之后将NK92MI分别与多种血液肿瘤细胞共同培养,2 h后用流式细胞分析方法检测靶细胞的凋亡率。结果显示:加入NKG2D特异性封闭抗体后,NK细胞对于急性髓系白血病细胞Kasumi-1的杀伤作用减弱约30%,而在其他血液肿瘤细胞株中封闭NKG2D并未明显影响NK细胞对于靶细胞的杀伤。结论:在NK细胞作用于某些靶细胞时,NKG2D促进NK细胞的杀伤作用。     

NKG2A、NKG2D在食管鳞癌不同病理分期的表达及其相关性分析

目的 分析不同病理分期食管鳞癌患者血清中自然杀伤细胞表面抑制性受体A(NKG2A)和自然杀伤细胞表面活化性受体D(NKG2D)表达水平的特点,探讨NKG2A和NKG2D在食管鳞癌不同病理分期的表达意义,并研究NK细胞、NKG2A、NKG2D与病理分期的相关性.方法 用流式细胞仪分析92例食管鳞癌患者及50例健康志愿者外周血NK细胞数量及其NKG2A和NKG2D的表达情况.结果 与正常对照组相比,食管鳞癌患者外周血NK细胞表达增加[(9.97±4.25)% vs.(16.22±8.91)%,t′=-5.646,P<0.01],NK细胞表面NKG2A的表达水平升高[(35.19±17.73)% vs.(47.35±18.88)%,t=-3.742,P<0.01],NKG2D的表达水平降低[(83.20±3.85)% vs.(80.60±9.09)%,t′=1.925,P=0.019];食管鳞癌患者NKG2A/NKG2D的比值与其病理分期呈正相关性(r=0.333,P<0.01),行线性回归分析得F=7.413,P=0.008,按α=0.05水准,回归方程为:Y(NKG2A/NKG2D的比值)=0.105X(食管鳞癌病理分期)+0.347;R2=0.276.结论 食管鳞癌患者机体NK细胞数目增多,NKG2A/NKG2D比值与食管鳞癌病理分期进展呈正相关;降低NKG2A,提高NKG2D的表达水平,能增强NK细胞对肿瘤的杀伤活性,从而为食管鳞癌的免疫治疗开创新的思路.     

和厚朴酚提高人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞对NK细胞杀伤敏感性的研究

目的:探讨和厚朴酚(honokiol,HNK)作用前后人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化及其可能机制.方法:MTT法检测和厚朴酚对Raji细胞的增殖抑制作用.乳酸脱氢酶释放法检测HNK作用前后Raji细胞对NK细胞的杀伤敏感性.流式细胞仪检测HNK作用前后Raji细胞表面NKG2D配体(MICAB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子的表达以及细胞周期变化.结果:HNK对Raji细胞的生长具有明显抑制作用.HNK作用后,Raji细胞对NK细胞的杀伤敏感性较HNK作用前显著增强(P＜0.05).HNK作用后,Raji细胞表面MICAB、ULBP2、ULBP3表达显著升高(P＜0.05),ULBP1和HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05),同时,细胞周期检测显示Raji细胞被阻滞在G0/G1期.结论:HNK能提高Raji细胞NKG2D配体(MICAB、ULBP1、ULBP3)的表达,从而使Raji细胞对NK细胞的杀伤敏感性增强,以达到杀伤肿瘤细胞的能力.     

NKG2D和NKG2A及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在急性白血病的表达及意义

本研究旨在初步探讨NK细胞受体NKG2D和NKG2A在初发ALL和AML患者NK细胞、CD3+T细胞的表达其及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞表达差异性和免疫学意义.用流式细胞术检测NK92细胞对8种白血病细胞系的杀伤效率,并检测60例初发急性白血病患者(ALL和AML各30例)骨髓中NKG2D和NKG2A在NK和CD3+T细胞的表达及其相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞的表达.结果表明,NK92对不同白血病细胞系的杀伤效率存在差异.ALL患者NK细胞和CD3+T细胞的NKG2D及NKG2A阳性表达率与AML患者相比均无显著差异(p>0.05),但是ALL患者白血病细胞MHC-I A/B和HLA-E阳性表达率均明显高于AML患者(p<0.05).结论:ALL与AML患者免疫细胞功能的差异性可能与白血病细胞配体表达的不同有关,而与本身NK及T细胞表达的杀伤和抑制性受体无关.     

NKG2D-IL-21融合基因修饰的结肠癌细胞体外刺激NK细胞活化的研究

目的观察含NKG2D-IL-21融合基因的重组表达载体转染结肠癌细胞后对NK细胞活化的影响。方法首先利用DNA限制性内切酶鉴定插入真核表达载体(pcDNA3.1-NKG2D-IL-21)的NKG2D和IL-21基因序列,并通过脂质体介导质粒转染结肠癌细胞株CT-26。流式细胞术胞内染色法检测CT-26内NKG2D-IL-21融合蛋白的表达,酶联免疫吸附实验鉴定细胞培养上清NKG2D-IL-21蛋白的含量。最后将经基因转染的CT-26细胞与小鼠脾脏NK细胞共培养,流式细胞术检测NK细胞表面活化性受体CD69的表达。结果 NKG2D-IL-21融合基因稳定插入pc DNA3.1载体。CT-26细胞经外源性NKG2D-IL-21融合基因转染后,表达含有NKG2D和IL-21的融合蛋白。分泌NKG2D-IL-21融合蛋白的CT-26细胞具有明显促进NK细胞表达CD69的活性。结论重组pcDNA3.1-NKG2D-IL-21真核表达载体可作为一种新型DNA疫苗。     

肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响

【目的】分析肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响。【方法】应用免疫荧光技术和流式细胞术 (FCM )分选 2 5例肝细胞癌 (HCC)、10例健康对照的外周血NK细胞 ,定量分析NKG2D蛋白表达。用MTT比色法检测抗NKG2DpAb加入前后NK细胞的细胞毒效应。【结果】HCC患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量均低于正常对照 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。抗NKG2DpAb能显著抑制NK细胞对K5 6 2、HepG2细胞的细胞毒效应 ,使NK细胞对两种靶细胞的细胞毒效应分别下降了 6 .7和 4 .1倍。【结论】NK细胞NKG2D表达异常与肝细胞癌的发生发展可能相关。     

食管癌放疗中MICA-NKG2D系统功能变化与疗效的临床研究

目的探讨食管癌在放疗中MICA-NKG2D配受体功能变化,以及其变化与放疗疗效的关系。方法取食管鳞癌细胞株ECA109,用不同剂量照射后用流式细胞术检测MICA表达。采用ELISA法检测接受不同放疗剂量的食管癌患者血清中sMICA浓度,采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达,胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化,并在结束时及结束后4周,用WHO评价标准评价放疗疗效,研究NK细胞NKG2D受体的表达率提高与放疗疗效的关系。1年后评价生存率与NK细胞NKG2D受体的表达率提高的关系。结果食管鳞癌细胞株ECA109仅当32 Gy的照射量才能诱导MICA明显表达并促进NK细胞对其的杀伤效应。放疗中食管癌患者血清内sMICA含量无明显变化,40~60 Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加,同时其NK细胞毒活性最强。放疗前后NKG2D阳性的NK细胞数增加越高的放疗后疗效评价越好。但1年后的评价未证实此结论。结论放疗可以促使食管鳞癌细胞诱导MICA明显表达并促进NK细胞对其的杀伤效应。放疗中食管癌患者血清sMICA含量无明显变化,但放疗可使NKG2D阳性的NK细胞数增多,增加越明显的患者短期放疗疗效越好,但对远期1年生存率没有明显的影响。     

食管癌放疗中MICA—NKG2D系统功能变化与疗效的临床研究

目的探讨食管癌在放疗中MICA-NKG2D配受体功能变化,以及其变化与放疗疗效的关系。方法取食管鳞癌细胞株ECA109,用不同剂量照射后用流式细胞术检测MICA表达。采用ELISA法检测接受不同放疗剂量的食管癌患者血清中sMICA浓度,采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达,胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化,并在结束时及结束后4周,用WHO评价标准评价放疗疗效,研究NK细胞NKG2D受体的表达率提高与放疗疗效的关系。1年后评价生存率与NK细胞NKG2D受体的表达率提高的关系。结果食管鳞癌细胞株ECA109仅当32Gy的照射量才能诱导MICA明显表达并促进NK细胞对其的杀伤效应。放疗中食管癌患者血清内sMICA含量无明显变化,40～60gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加,同时其NK细胞毒活性最强。放疗前后NKG2D阳性的NK细胞数增加越高的放疗后疗效评价越好。但1年后的评价未证实此结论。结论放疗可以促使食管鳞癌细胞诱导MICA明显表达并促进NK细胞对其的杀伤效应。放疗中食管癌患者血清sMICA含量无明显变化,但放疗可使NKG2D阳性的NK细胞数增多,增加越明显的患者短期放疗疗效越好,但对远期1年生存率没有明显的影响。     

结肠直肠癌患者围手术期NK细胞活化性受体NKG2D与其配体MICA/B的表达

目的观察结肠直肠癌(CRC)患者手术前后自然杀伤细胞(NK细胞)活化性受体NKG2D与其配体MICA/B的表达,探讨NKG2D-MIC系统与肿瘤逃避免疫监视的关系。方法流式细胞术检测45例CRC患者和35例健康体检者(对照组)外周血NK细胞活化性受体NKG2D的表达,组织MICA/B的表达;ELISA检测血清MICA(sMICA)的浓度。结果 CRC组术前NKG2D、MICA/B的表达均降低,sMICA浓度增高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后NKG2D的表达无显著增高,sMICA浓度无显著降低,与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 CRC患者血清高水平的sMICA,抑制了NKG2D-MIC介导的抗肿瘤免疫,导致CRC患者NK细胞抗肿瘤免疫低下。NKG2D低表达,sMICA高浓度的情况术后短期内不能迅速逆转。     

小鼠MIC及其受体mNKG2D的结构、表达和功能

主要组织相容性复合体I相关抗原(MHC class Ⅰ related antigen,MIC)是一类与人类白细胞抗原Ⅰ(Human Leukocyte Antigen -Ⅰ,HLA-Ⅰ)紧密相连的诱生性抗原,是自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)受体NKG2D的配体,与NKG2D相互作用可传递强烈的活化信号,引发各种天然免疫反应和特异性免疫反应.     

多发性骨髓瘤患者可溶性MICA和NK细胞NKG2D受体的检测

目的 检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者血清可溶性主要组织相容性复合物Ⅰ类相关链A（soluble MICA, sMICA）和天然杀伤（NK）细胞表面NKG2D（naturalkiller group 2,member D）受体表达的关系。 方法 ELISA法检测38例MM患者和40例健康人对照的血清sMICA含量,流式细胞术检测外周血NK细胞表面NKG2D受体的表达。 结果 MM患者血清sMICA为（458±207）pg/ml显著高于健康对照组（135±82）pg/ml(t=9.133,P<0.01);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者血清sMICA(pg/ml)分别为258±126、489±191和585±163,Ⅱ期和Ⅲ期均高于Ⅰ期患者(t分别为3.377和5.172,P均<0.01)。回归分析显示MM患者血清sMICA含量与外周血NK细胞表面NKG2D受体水平呈负相关（r=-0.749,P<0.01）。 结论 MM患者血清sMICA含量变化与该病的发生及疾病活动性有一定关联。     

细胞因子诱导的杀伤细胞在临床常见肿瘤中的应用现状

细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是由多种细胞因子,如白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)和CD3单克隆抗体等诱导而成的,对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性T细胞,其溶瘤活性具有非MHC限制性,并且能特异地聚集于肿瘤局部发挥抗肿瘤作用[J].CIK细胞是以CD3+ CD8+、CD3+ CD56+为主的一群异质性细胞,具有较强的增殖活性、杀伤活性和广谱抗肿瘤活性.CIK细胞主要通过3条途径杀伤肿瘤细胞:(1)通过表面表达NKG2D受体(natural killergroup 2D receptor)识别肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体,直接杀伤肿瘤;(2)进入体内的CIK细胞能分泌多种细胞因子:IL-2、γ-IFN、肿瘤坏死因子(TNF)等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,还可以通过调节机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞,同时增强T细胞的抗瘤功能;(3)通过表达Fasl诱导肿瘤细胞凋亡,同时表达抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-xL、survivin)来抵抗Fasl阳性的肿瘤细胞对其的反作用,使CIK细胞可以耐受表达凋亡相关因子配体的肿瘤细胞诱导的凋亡,从而发挥持久的抗肿瘤效应[2].     

刺激NKG2D配体表达在血液肿瘤免疫治疗中的意义

NKG2D是表达在自然杀伤细胞（NK细胞）表面的重要的活化性受体。它能够识别不同的NKG2D配体分子,激活NK细胞的抗肿瘤活性。大多数正常组织不表达NKG2D配体,而病毒感染或者基因毒性药物等细胞压力可以通过DNA损害的途径刺激NKG2D配体分子表达,从而增强肿瘤细胞对NK细胞的敏感性。本文主要阐述刺激NKG2D配体表...     

NK细胞表面CD160分子表达及其介导NK杀伤效应机制的初步研究

目的:研究CD160分子在人自然杀伤(NK)细胞中的表达及与血液肿瘤的可能关系。方法:从RNA和蛋白水平确定人白血病细胞系NK92细胞表达CD160,并检测该细胞系的增殖特征及细胞表面分子的表达特点。建立以NK92为效应细胞、人白血病细胞系K562或THP-1为靶细胞的杀伤反应体系。加入CD160阻断抗体CL1-R2后,明确其对NK92细胞杀伤功能的影响。同时,采用流式细胞术检测不同种类初发血液肿瘤患者的外周血标本中NK细胞的CD160表达水平。结果:RT-PCR及Western blot杂交检测到NK92表达CD160,流式细胞学检测到NK92细胞表面CD160表达强阳性。NK92可有效杀伤2种白血病靶细胞,抗体阻断CD160后,NK92的杀伤功能被显著抑制。2种靶细胞均高表达HVEM,而K562不表达HLAⅠ类分子。不同种类血液肿瘤患者的外周血CD3-CD56+NK细胞CD160表达均低于正常对照细胞。其中急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)受者组与正常对照之间有显著性差异(P 0. 05)。结论:人CD160分子参与并介导了NK细胞的部分杀伤功能,血液肿瘤患者NK细胞表面CD160分子表达存在不同程度的下降,提示CD160表达的下调可能是血液系统肿瘤免疫逃逸的一种新机制。     

分娩发动前后体内NK细胞、NKT细胞表型分析

目的研究分娩发动前后蜕膜及外周血中NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况,探讨其在产程发动中的作用。方法选取正常孕足月孕妇分为分娩发动经阴道分娩组（以下简称分娩组20例）和分娩未发动行选择性剖宫产术组（以下简称剖宫产组20例）,分离蜕膜及外周血中单个核细胞后采用流式细胞学技术分别检测CD56＋细胞、NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况。结果外周血单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋细胞构成下降、CD56＋NKG2D＋细胞构成增加,NK细胞、NKT细胞表面NKG2D表达上升。蜕膜单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋和CD56＋NKG2D＋细胞构成及NK细胞表面NKG2A和NKG2D表达均下降,NKT细胞表面NKG2A和NKG2D表达无显著差异。结论临产前体内NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体表达的变化可能在在产程的发动中起着重要作用。