HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系顺铂耐药性的变化

目的　人乳头瘤病毒 16型 E6 E7区基因编码的蛋白具有转导人上皮细胞 ,使之获得永生化特性的作用。为建立卵巢癌永生细胞系 ,我们对 HPV16 E6 E7转导卵巢癌细胞的方法及转导细胞对顺铂的耐药性进行了研究。　方法　采用脂质体方法 ,将含有 HPV16 E6 E7的重组逆转录病毒载体 p L XSN16 E6 E7,转染逆转录病毒包装细胞 PT6 7,经 G418筛选 ,病毒滴度测定 ,筛选出 1株高滴度 (1.9× 10 7/m l)的产病毒克隆 ,将之转导卵巢癌细胞系SKOV3、3AO,各筛选出 1株稳定表达 HPV16 E6 E7的克隆 ,SKOV3/E6 E7、3AO/E6 E7。经 RT- PCR、免疫细胞化学检测证实 HPV16 E6 E7的表达 ,之后采用 MTT法检测了 HPV16 E6 E7转导的卵巢癌细胞系对顺铂耐药性的变化。结果　 HPV16 E6 E7转导的卵巢癌细胞系 SKOV3/E6 E7、3AO/E6 E7对顺铂的耐药性无改变。　结论　HPV16 E6 E7转导的卵巢癌细胞没有发生顺铂耐药性的改变。本研究为采用此法建立卵巢癌永生细胞系 ,特别是建立耐药卵巢癌细胞系奠定了基础。     

HPV16,18E6蛋白与p21ras,p53在食管癌组织中表达

采用ＳＰ免疫组化法对５２例食管鳞状细胞癌和３０例食管粘膜慢性炎（对照组）进行高危ＨＰＶ１６、１８Ｅ_６和ｐ２１ｒａｓ、ｐ５３癌基因产物的检测。结果表示：鳞癌组中Ｅ_６的阳性率为６７．３１％，与对照组相比差异有极显著性（Ｐ＜０．００１），其中Ｅ_６与ｐ５３呈双阳性者为５５．７７％（２９／５２）、８９．６６％（２６／２９），显示两者阳性着色出现在部分相同区域同一癌细胞核内（似表明Ｅ_６可与ｐ５３结合形成复合物从而导致野生型ｐ５３的降解）。本组ｐ２１ｒａｓ与ｐ５３、ｐ５３与Ｅ_６的阳性表达均具相关性（Ｐ＜０．０５）。提出ＨＰＶ１６、１８感染与本地区食管癌病因学密切相关，Ｅ_６抗体是诊断ＨＰＶ１６、１８感染的良好标记。     

HPV16/18E6/E7蛋白抗原表位理论预测与分子模拟研究

目的人乳头瘤病毒(HPV)与全球约4.5%的癌症密切相关,与几乎所有宫颈癌相关,其中HPV16和HPV18约占70%。方法鉴于E6/E7蛋白是维持HPV阳性癌细胞恶性表型的关键因素,是开发治疗性HPV疫苗的潜在靶标,通过分子模拟理论预测潜在抗原表位可以为疫苗开发提供理论指导。结果本研究利用在线工具预测HPV16、HPV18 E6/E7蛋白的潜在抗原表位,通过分子动力学模拟获得表位与MHC结合的稳定构象,结合自由能计算结果显示表位KLPDLCTEL(-31.02 kcal/mol)、TLQQDIVLHL(-31.33 kcal/mol)、YMLDLQPET(-34.09 kcal/mol)与HLA-A*0201具有潜在结合能力。结论通过分析表位与MHC结合模式,为表位的改造与HPV治疗性疫苗研究提供了理论线索。     

HPV16E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价

目的 构建用于宫颈癌治疗的HPV16E7E6重组腺病毒并评价其免疫效果.方法 根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPV16E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成.将合成的E7E6基因插入腺病毒重组穿棱质粒pCD316后,与Ad5腺病毒骨架质粒共转染293细胞,重组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定.扩增纯化重组病毒后免疫小鼠,评价其免疫活性.结果 PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入Ad5病毒;Western blot检测结果表明重组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达,该重组腺病毒免疫C57小鼠后,可诱发强特异性T细胞免疫应答,在小鼠体内能完全抑制5×104 TC-1移植瘤细胞的生长.结论 重组HPV16E7E6腺病毒可作为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗.     

间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染

建立稳定的原位ＰＣＲ方法,并探讨ＨＰＶ感染与喉鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化、原位杂变、ＰＣＲ和间接原位ＰＣＲ技术,检测了５０例喉鳞癌中的ＨＰＶ感染情况。结果免疫组化衣壳抗原阳性者６例（１２％）,原位杂交阳性者１３例（２６％）,ＰＣＲ阳性者１０例（２０％）,原位ＰＣＲ阳性者１７例（３４％）,综合上述方法的检出率为４２％（２１例）。结论ＨＰＶ感染与喉癌有着明显的关系,间接原位ＰＣＲ在检测ＨＰＶ感染     

HPV16E7基因疫苗诱导小鼠细胞免疫功能的实验研究

目的：探讨重组HPV16E7质粒免疫小鼠后诱导的细胞免疫反应。方法：将BALB／c实验小鼠随机分为三组，实验组小鼠免疫peDNA3．1-HPV16E7，对照组Ⅰ小鼠免疫peDNA3．1，对照组Ⅱ小鼠注射生理盐水。每周免疫一次，共免疫三次。末次免疫后一周，眼眶取血后处死小鼠。体外进行脾淋巴细胞增殖反应；流式细胞仪检测脾细胞亚群比率和外周血CD^4 、CD^8 淋巴细胞亚群数量；ELISA法检测脾细胞培养上清和血清中IFN-γ的含量。结果：peDNA3．1-HPV16E7免疫小鼠的脾细胞增殖反应明显高于对照组。CD^4 细胞数、CD^4 ／CD^8 比值及脾细胞培养上清和血清中的IFN-γ含量均高于对照组。结论：peDNA3．1-HPV16E7重组质粒可诱导BALB／c小鼠产生特异性细胞免疫反应。     

HPV16、18 E6蛋白在乳腺癌组织中的表达

目的：观察ＨＰＶ１６ 、１８ Ｅ６ 蛋白在人乳腺癌中的表达并探讨ＨＰＶ１６、１８ 感染与乳腺癌病因学的关系。方法：应用ＳＰ免疫组化法,检测５３ 例乳腺癌、２０ 例正常乳腺组织中ＨＰＶ１６、１８ Ｅ６ 蛋白的表达。结果：乳腺癌组织中ＨＰＶ１６、１８ Ｅ６ 蛋白的阳性表达率为５６－６％ （３０／５３）,多种组织学类型的乳腺癌组织中有ＨＰＶ１６、１８ 型感染的存在。结论：ＨＰＶ１６、１８ 型感染可能与乳腺癌的病因学密切相关。     

HPV16预防性疫苗的相关研究动态

人类乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）在宫颈癌患者中检出率高达９０％。近年来通过基因工程方法对ＨＰＶ的晚期基因（Ｌ１和Ｌ２基因）编码的外壳蛋白产物的研究很多，发现主要壳蛋白（Ｌ１）可自我组装成病毒样颗粒（ＶＬＰ），并可用途预防性疫苗；基于次要壳蛋白（Ｌ２）的预防性疫苗和核酸水平的预防性疫苗也很有前途。本文就近几年的研究进展及趋势作一综述。     

宫颈癌细胞系SiHa中HPV16E6,E7蛋白的表达

我们应用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜(ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ,ＬＳＣＭ),观察了宫颈癌细胞系ＳｉＨａ中ＨＰＶ１６型(ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６)Ｅ６,Ｅ７基因区产物Ｅ６,Ｅ７蛋白的表达。１材料与方法１．１材料含ＨＰＶ基因的宫颈癌细胞系ＳｉＨａ,由西安医科大学分子生物研究中心李旭教授提供。用含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基(Ｇｉｂｃｏ公司)常规培养后,滴于盖玻片培养,制成单层细胞爬片。１．２方法免疫荧光染色用正常羊血清封闭…     

宫颈癌患者外周血中的人乳头瘤病毒16例E6及E7蛋白…

本研究证明进展期宫颈癌患者１０／３７例和１０／４６例外周血中分别存在有ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７蛋白致敏的淋巴细胞，而４０例献血员中分别为１２．５％（５／４０）和１７．５％（７／４０）。４６例中有１７例和２５例分别进行了宫颈癌组织中的ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７基因序列检测，Ｅ６蛋白致敏淋巴细胞阳性的６例中检出与未检出Ｅ６序列的各占３例，Ｅ７蛋白致敏淋巴细胞阳性的５例中有３例未检出，有２例检出Ｅ７序列。     

乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16感染的研究

目的 :了解乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16的感染情况 ,分析其是否是乳腺癌发生的危险因素及与临床病理的相关性。方法 :根据HPV16、HPV18的DNA序列 ,合成相应特异的寡核苷酸片段 ,用加尾标记法制备地高辛标记探针 ,用原位杂交法检测 5 1例乳腺浸润性导管癌、10例相应正常乳腺上皮及 15例良性乳腺病变中HPV18、HPV16的感染 ,并分析其与患者发病年龄、肿块大小及淋巴结转移的相关性。结果 :浸润性导管癌中HPV18或 16的总阳性率达 70 6 % ,其中HPV18与HPV16的阳性率分别为 5 8 8%、4 5 1% ,均明显高于正常乳腺上皮的感染率 (30 0 %、10 0 % ;P <0 0 5 ) ;乳腺良性病变的HPV18、16阳性率分别是 6 0 0 %、6 0 % ,其中HPV18的阳性率亦显著高于正常乳腺上皮 (P <0 0 5 )。结论 :(1)HPV16和18可能是乳腺浸润性导管癌发生的致病因子 ,HPV18尚可能与乳腺良性病变的发生有关。 (2 )HPV的感染与患者年龄、肿块大小及淋巴结转移无相关性。     

P16,Ki67与HPV16/18在宫颈病变中的表达及其临床意义

目的:研究多肿瘤抑制基因P16、细胞核增殖抗原Ki67及高危型入乳头状瘤病毒(high risk human papilloma virus,HPV16/18)在宫颈病变中的表达和临床意义.方法:采用免疫组织化学Elivision两步法检测P16和Ki67在宫颈非特异性炎症、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级及宫颈鳞状细胞癌中的表达,用原位杂交法检测HPV16/18的表达.结果:P16蛋白表达在非特异性炎症、CIN Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级及宫颈癌中的阳性率分别为20.0％,55.6％,93.6％和100.0％; Ki67蛋白表达在非特异性炎症、CIN Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级及宫颈癌中的阳性率分别为17.6％,61.1％,89.4％和100.0％,不同组别间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).而且Pi6和Ki67的阳性表达率及染色强度呈递增趋势,表达存在分层现象.HPV16/18在非特异性炎症、CIN I级、Ⅱ级、Ⅲ级及宫颈癌中的阳性率分别为30.0％,61.1％,82.9％和100.0％,宫颈病变中HPV16/18的阳性率显著高于非特异性炎症组.结论:P16和Ki67蛋白检测作为宫颈病变的有效的生物学标记,可联合HPV16/18 DNA检测应用于宫颈癌及其癌前病变的筛查和诊断中.     

抗HPV16E6核酶的原核表达与体外活性研究

目的 获得一种特异性抗人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗ＨＰＶ相关性肿瘤。方法 以核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ,Ｒｚ）的垂头结构为模型,采用计算机软件针对ＨＰＶ１６Ｅ６基因,设计相应的Ｒｚ;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中。将ＨＰＶ１６Ｅ６基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒ｍＲＮＡ,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性。结果 抗ＨＰＶ１６     

HPV E6/E7 mRNA与HPV E6/E7 DNA在筛查宫颈鳞状上皮内病变中的应用价值

目的通过回顾性统计分析比较人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA和DNA两种检测方法,探讨两者在筛查宫颈鳞状上皮内病变中的作用。方法选取2018年10月~2019年10月于甘肃省中医院病理科行液基薄层细胞学检查的206例患者,进行HPVE6/E7mRNA检测、HPVE6/E7DNA检测及p16免疫组化染色,观察不同细胞学和组织学分级的检测结果。结果不同细胞学分级,HPVE6/E7mRNA和DNA的阳性率随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势（P<0.05）,意义不明确的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）中HPVE6/E7mRNA的检出率低于HPVE6/E7DNA（P<0.05）。不同组织病理学分级,HPVE6/E7mRNA和DNA的阳性率随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势（P<0.05）,低级别鳞状上皮内病变（LSIL）中HPVE6/E7mRNA的检出率低于HPVE6/E7DNA（P<0.05）。p16免疫组化染色阳性率随宫颈鳞状上皮内病变级别的升高呈递增趋势（P<0.05）。HPVE6/E7DNA+p16联合筛查宫颈鳞状上皮内病变灵敏度最高,HPVE6/E7mRNA的特异度最高;在LSIL中,HPVE6/E7DNA的阳性预测值最高,在高级别鳞状上皮内病变（HSIL）中HPVE6/E7mRNA+p16的阳性预测值最高。结论在筛查宫颈鳞状上皮内病变时,HPVE6/E7DNA检测加p16免疫组化染色的灵敏度最高;HPVE6/E7mRNA能更准确地反映HPV的活化状态;在HSIL筛查中,HPVE6/E7mRNA加p16免疫组化染色则更具有特异性。     

人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究

构建了含人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）－Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ（ｎｔ８３－８５５）片段和ＨＰＶ１６长控制区（ＬＣＲ）加Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ片段（ｎｔ７００７－７９０４／０－８７９）的逆转录病毒载体ｐＨ２１和ｐＨ１８质粒，利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将它们导入病毒包装细胞ｐＡ３１７中，经过筛选获得Ｇ４１８抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒Ｈ２１和Ｈ１８感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能在裸鼠体内形成肿瘤。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明，上述两基因片段都整合到细胞基因组中。本实验结果说明ＨＰＶ１６－Ｅ６Ｅ７基因片段是ＨＰＶ１６转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞的关键早期区，其自身ＬＣＲ区在该转化过程中没有显示出重要作用。     

HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

目的分析HPV18E2蛋白的CTL表位,合成并纯化这些表位多肽,构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞,检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果,为进一步研制人乳头瘤病毒18型（HPV18）基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒（pBR322-HPV18）为模板,利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段,将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒（pIRES2-EGFP）重组构建重组质粒（pIRES2-HPV18E2-EGFP）。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51^Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2-EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论三条备选肽段都具有明显的杀伤效应,均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。     

特异性HPV16E7 CTL表位肽-MHC I复合物单抗的制备及鉴定

目的制备抗HPV16E7CTL表位（49-57）-MHC Ⅰ类分子复合物的特异性单克隆抗体，并对其敏感性、特异性及亲和力进行鉴定，为今后研究HPV16感染后机体对病毒蛋白的免疫呈递途径研究奠定基础。方法制备高纯度的HPV16E7 CTL表位（49．57）肽RAHYNIVTF，将其与TAP缺陷的RMA-S细胞孵育后免疫BALB／c小鼠，常规收集小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合，筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆，并对其进行一系列鉴定。结果筛选出的杂交瘤细胞株能稳定分泌抗HPV16E7（49．57）-MHC Ⅰ类分子复合物的单抗，不仅能与装载有RAHYNIVTF的TAP缺陷的RMA-S细胞结合，也能与具有内源性抗原处理能力的RMA细胞结合，但不能与装载有类似变异肽（进行氨基置换后的RAHYNIVTF）或乙肝病毒对照肽的RMA-S或RMA细胞反应，具有良好的敏感性、特异性及亲和力。结论本实验制备表位肽．MHC Ⅰ类复合物单抗的方法，对今后研究包括HPV16感染在内的病毒感染免疫有很大的临床应用价值。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

HPV病毒16型感染的影响因素研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV) 16型感染的相关影响因素.方法 采用调查问卷的方式对1500例自愿进行宫颈脱落细胞HPV检测的筛查者进行调查,收集筛查者的基本信息、婚育史、月经情况、性行为情况、饮酒史、吸烟史、妇科手术史、卫生情况等,采用x2检验与多因素Logistic回归分析HPV病毒16型感染的相关影响因素.结果 1500例筛查者中,HPV阳性率为12.8％(192/1500),主要类型包含HPV16型40.1％(77/192),HPV58型16.7％(32/192),HPV18型10.4％(20/192).单因素分析结果显示,HPV16型感染的相关影响因素是吸烟史、很少进行妇科检查、首次性交年龄＜25、怀孕次数≥2、流产次数≥3、妇科手术史、性伴侣数目≥2.多因素Logistic回归分析结果显示,HPV16型感染的危险因素是吸烟史、首次性交年龄＜25、妇科手术史.结论 HPV16型感染的危险因素是吸烟史、首次性交年龄＜25、妇科手术史,应尽量避免.