不同浓度万古霉素对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的 观察不同浓度万古霉素对兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖、成骨分化的影响.方法 将兔MSCs置于含不同浓度的万古霉素,以及添加了成骨诱导剂的培养液中培养,采用MTT法观察万古霉素对MSCs增殖的影响,不同时相点测定ALP值,钙结节染色观察万古霉素对MSCs的成骨影响.结果 MSCs可在不同浓度万古霉素溶液中生长,当万古霉素浓度≤700μg/ml时,万古霉素对MSCs的增殖无影响,当浓度≥1000μg/ml时,才对MSCs的增殖有一定影响.万古霉素浓度≤1000μg/ml时,实验组与对照组在不同时相点ALP无明显差异.同时钙结节茜素红染色阳性.结论 万古霉素对MSCs增殖、成骨分化影响较小,是预防和治疗骨科临床感染的较好选择.     

富血小板血浆对人脐带间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度富血小板血浆(PRP)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的增殖及成骨分化影响.方法 提取脐带血PRP,ELISA试剂盒测定PRP中转化生长因子-β1(TGF-β1)浓度,并将其作为PRP生长因子含量的衡量标准,分别以含不同浓度TGF-β1的PRP培养hUC-MSCs,CCK-8法检测细胞增殖效率.将P5代hUC-MSCs接种于6孔板,分为4组:对照组只添加完全培养基培养,PRP组添加TGF-β1为750 pg/mL的PRP培养,成骨诱导组添加成骨诱导培养基培养,PRP+成骨诱导组添加TGF-β1为750 pg/mL的PRP和成骨诱导培养基培养.Real-time PCR检测hUC-MSCs成骨标志基因(OPN、RUNX2、ALP)的相对表达量.结果 细胞培养至第5天时,含TGF-β1浓度为750、1000、2000pg/mL的PRP对细胞增殖促进作用显著.此外,成骨诱导过程中,添加PRP对细胞形态有不同程度影响,相对于成骨诱导组,PRP+成骨诱导组细胞第14天时已有明显的钙沉积.Real-time PCR结果显示,对照组细胞在各时间点成骨标志基因只有微量表达,且无明显变化.其余3组细胞随培养时间增加,成骨标志基因表达均有不同程度上调,其中,PRP组高于对照组(P＜0.05),成骨诱导组高于PRP组(P＜0.05),PRP+成骨诱导组高于成骨诱导组(P＜0.05).结论 体外培养时PRP可促进hUC-MSCs增殖及成骨分化,PRP中TGF-β1最佳浓度为750 pg/mL.     

抑瘤素M对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨抑瘤素M（OSM）对体外培养的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）增殖及成骨分化的影响,阐明OSM是一种有效的成骨诱导活性因子。方法：体外培养hUCMSCs,流式细胞术检测第3代hUCMSCs表面标志物;CCK-8法测定不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1）重组人抑瘤素M（rhOSM）处理后hUCMSCs的增殖活性。将hUCMSCs分为对照组、经典成骨诱导剂组和不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1） rhOSM组,于成骨诱导第4、7和14天,采用BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶（ALP）染色并定量检测细胞中ALP活性,茜素红染色法检测钙结节的生成情况并半定量分析细胞矿化活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测hUCMSCs中Runt相关转录因子2（Runx2）和OCN mRNA表达水平。结果：hUCMSCs符合间充质干细胞（MSCs）鉴定标准。rhOSM处理hUCMSCs 72 h,与对照组比较,10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;处理96 h,与对照组比较,各剂量rhOSM组细胞增殖活性均明显降低（P<0.05）,且各剂量rhOSM组组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。成骨诱导第4、7和14天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组ALP活性和Runx2 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;与成骨诱导第7天比较,诱导第14天各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平略降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。成骨诱导第7、14和21天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞矿化活性均明显升高（P<0.01）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞矿化活性明显升高（P<0.05）。与经典成骨诱导组比较,各剂量rhOSM组OCNmRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;成骨诱导第7、14和21天,与0.1μg·L^-1rhOSM组比较,1.0和10.0μg·L^-1rhOSM组细胞中OCNmRNA表达水平明显升高（P<0.05）,具有时间-剂量依赖性。结论：rhOSM通过上调Runx2和OCN的表达及增加成骨细胞ALP的活性和钙盐沉积促进hUCMSCs体外成骨分化,是一种有效的成骨诱导活性因子。     

浓缩生长因子提取液对牙龈间充质干细胞增殖及成骨分化的促进作用

目的 探讨浓缩生长因子提取液(CGFe)对人牙龈间充质干细胞(GMSCs)增殖以及成骨分化的影响。方法 体外培养GMSCs,实验组采用含CGFe的α-MEM(含10%的胎牛血清)培养细胞,对照组使用不含CGFe的α-MEM(含10%的胎牛血清)培养细胞。MTT法测定GMSCs细胞的增殖情况,成骨诱导1、3、5、7 d检测碱性磷酸酶(ALP)的活性,14 d和21 d进行茜素红染色检测细胞形成钙结节的情况,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态。结果 与对照组相比,实验组在第1、3、5天的吸光度有显著提高,P<0.05。在评价GMSCs的ALP活性时,实验组在第1、3、5、7 d的吸光度显著高于对照组,P<0.05或<0.01。评价成骨分化活性,采用茜素红(Sigma)染色检测矿化结节。实验组在第7、14 d钙结节整体吸光度明显高于对照组,P<0.01。结论 CGFe能够促进GMSCs增殖以及成骨分化。     

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨能力的影响.方法 取大鼠骨髓组织,密度梯度离心法体外分离培养BMSCs.取第3代细胞接种,分别加入含0.5％、1％、2％、5％、10％ PRP的成骨诱导液或DMEM培养基进行培养,并以加入不含PRP的成骨诱导液或DMEM培养基培养(0 PRP)的BMSCs作对照.采用XTr比色法测定BMSCs的增殖情况.分别于培养3、7、11d时用ELISA法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,培养7、14、21 d时用放射免疫法检测骨钙素(OCN)表达量,培养21 d时用茜素红染色观察钙化结节形成能力.结果 成骨诱导培养的前7d,PRP可促进BMSCs增殖,成骨诱导培养7d以后,PRP也可促进BMSCs的成骨分化,且随着PRP浓度的增加,促细胞增殖、分化和成骨能力逐渐增强.PRP促进BMSCs内ALP活性和OCN表达的作用也呈剂量依赖性.成骨诱导培养21 d后,5％、10％的PRP诱导钙化结节形成能力优于0.5％、1％和2％的RPR,0 PRP培养的BMSC仅见少量钙化结节形成.结论 在体外成骨诱导培养条件下,RPR能有效促进BMSCs的生长增殖和成骨分化,以浓度10％为最佳.     

他克莫司对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:研究他克莫司对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的影响。方法:取小鼠BMSC分为3组,低、高剂量他克莫司组分别用含不同浓度(50、500 nmol/L)他克莫司的成骨诱导培养基培养,空白对照组用不含他克莫司的成骨诱导培养基培养。培养3 d,通过CCK-8法检测细胞的增殖能力;培养5、10 d,采用qRT-PCR检测成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osterix)、碱性磷酸酶(Alp)、骨钙蛋白(Ocn)mRNA的表达水平;培养10、14 d,用ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨分化能力。结果:与空白对照组相比,低、高剂量他克莫司组BMSC增殖能力增强,成骨分化相关基因Runx2、Osterix、Alp、Ocn表达上调,ALP活性增强,矿化结节形成增多(P<0.05)。结论:他克莫司可促进小鼠BMSC的增殖和成骨分化。     

两种不同形状碳酸钙微米颗粒对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化影响的研究

目的：评价球形和方形两种碳酸钙微米粒对大鼠骨髓来源间充质干细胞增殖、分化等的影响。方法制备球形和方形碳酸钙微粒并与大鼠骨髓间充质干细胞共培养,通过MTS法检测微粒对细胞增殖的影响,同时检测微粒在细胞表面的吸附以及引起的ROS反应,评价微粒的细胞毒性。通过检测碱性磷酸酶活性评价两种碳酸钙微粒对细胞成骨分化的影响。结果两种碳酸钙微粒高浓度下造成一定细胞增殖抑制,方形微粒抑制作用更显著。微粒的细胞增殖抑制主要由微粒与细胞表面接触引起,但两种微粒均不引起细胞ROS水平升高。同时两种微粒高浓度下也可通过抑制碱性磷酸酶活性抑制成骨分化,方形微粒同样更明显的抑制碱性磷酸酶活性。结论高浓度下碳酸钙微粒可对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化造成抑制,方形碳酸钙微粒具有更明显抑制现象,生物相容性不如等粒径球形微粒。因此球形微粒是组织工程支架材料更理想的选择。     

肝细胞损伤条件培养基对大鼠骨髓间充质干细胞肝向分化的促进作用

目的：制备肝细胞损伤条件培养基（CM）,体外模拟损伤组织微环境,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）肝向分化的作用。方法：取1周龄乳鼠,经差时贴壁和差速梯度法结合优化梯度离心和贴壁换液时间分离培养BMMSCs。取6~8周龄大鼠,腹腔注射60%四氯化碳溶液（0.75 mL·kg^-1）制备肝细胞损伤组织匀浆上清（CM1）和肝细胞损伤血清（CM2）。将第3代（P3）BMMSCs随机分为0% CM组（对照组,采用10% FBS L-DMEM培养）、10% CM1组、20% CM2组和10% CM1+10% CM2组。倒置显微镜下观察细胞形态表现,免疫组织化学法检测各组BMMSCs表面标志物CD105和各组细胞中白蛋白（ALB）的阳性表达率,油红O染色法检测BMMSCs成脂分化的脂滴形成阳性率;RT-PCR法检测各组细胞中甲胎蛋白（AFP）和ALB的表达水平,糖原染色法检测细胞中糖原合成阳性率,鉴定并比较各组BMMSCs肝向分化能力。结果：骨髓细胞原代培养72 h,贴壁细胞呈圆形或梭形,铺满瓶底时呈均匀有序的成纤维梭形状,P3 BMMSCs表面标志物CD105呈阳性表达。P3 BMMSCs经地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和消炎痛（DX+IBMX+IS+ID）联合诱导后4 d,镜下可见脂滴形成。P3 BMMSCs经CM诱导后细胞中AFP和ALB呈阳性表达,细胞糖原染色呈阳性。诱导后7 d,含CM成分的3组BMMSCs中均可见细胞胞浆内容物变得丰富,细胞呈圆形、三角形或肝板样排列;诱导后7、14和21 d,与对照组比较,含CM成分的3组BMMSCs中ALB阳性表达率均明显增加（P<0.01）;10% CM1+10% CM2组BMMSCs中ALB阳性表达率高于10% CM1组和20% CM2组（P<0.05）。诱导后7和14 d,与对照组比较,含CM成分的3组BMMSCs中糖原合成阳性率均明显增加（P<0.01）;10% CM1+10% CM2组BMMSCs中糖原合成阳性率高于10% CM1组和20% CM2组（P<0.05）。结论：CM1和CM2可诱导大鼠BMMSCs向肝细胞分化,在达到相同诱导作用效果时所需的CM1和CM2浓度更低;CM1和CM2提供的微环境更有利于BMMSCs向肝细胞分化,其诱导细胞分化效率更高。     

去分化间充质干细胞成骨再分化潜能的实验研究

目的:研究去分化间充质干细胞(de－differentiated mesenchymal stem cells,De－MSCs)成骨再分化能力?方法:以MSCs为对照,分别采用Cell Count Kit(CCK8)法?实时定量PCR(qPCR)?碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色法检测De－MSCs增殖能力?成骨相关基因?成骨再分化能力等?结果:De－MSCs可表达干细胞表面标志,在成骨培养基中增殖能力高于MSCs(P < 0.05),成骨相关基因(Runx2?Osterix?Bmp2)表达明显增加(P < 0.05),ALP活性检测发现De－MSCs明显高于MSCs组(P < 0.05),28 d后茜素红染色可见红色结节?结论:De－MSCs具备某些MSCs特征,但是体外再次成骨效率明显提高,De－MSCs可作为更优质种子细胞,为再生医学开拓新的思路?     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的增龄变化

目的观测年龄对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响.方法使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期、碱性磷酸酶活性.结果低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、增殖期比例大、MTT及碱性磷酸酶活性高.结论hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低,建立其参数可满足组织工程种子细胞在临床应用中不同患者的要求.     

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中, 其对干细胞增殖及分化的影响。方法:分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs,以不同浓度5-Aza作用,用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力,观察细胞形态变化,通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果:0和1 μmol·L-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响;随着5-Aza浓度的增高,MSCs 的增殖逐渐减弱;20～30 μmol·L-1 5-Aza对细胞有毒性作用,影响其增殖。3和6 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达;9和12 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达,该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗,12 d有肌管样细胞出现。结论:5-Aza影响干细胞分化,调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。     

地塞米松对兔骨髓间充质干细胞存活增殖成骨的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)的持续生存能力及地塞米松对其存活、增殖、成骨分化能力的影响。方法:提取兔BMSCs,予不同浓度(0、10-9、10-8、10-7、和10-6mol/L)地塞米松,分别于1、3、5、7 d时观察地塞米松对BMSCs增殖的影响,作用1～4周后检测碱性磷酸酶水平;分别饥饿0～7 d,复苏1、3和7 d后,观察BMSCs的持续生存能力。结果:培养1 d地塞米松10-6mol/L组测得的OD值结果最高,而对照组结果最低,培养3、5、7 d时,地塞米松10-9mol/L组测得的OD值最高;同时,在2～4周10-9mol/L组增加碱性磷酸酶活性最明显;复苏1和3 d,对照组与饥饿1～7 d之间差异有统计学意义(均P<0.05),复苏7 d,各组两两之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:BMSCs具有较强的持续生存能力,地塞米松对BMSCs有增加存活、促进增殖、成骨分化的作用。     

骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖分化的影响

目的：观察骨髓源性内皮祖细胞( EPCs)对脊髓源性神经干细胞( NSCs)增殖分化的影响。方法通过密度梯度离心法获取骨髓血单个核细胞,以 EBM-2进行诱导培养EPCs并进行免疫细胞化学染色鉴定,成熟的方法获取及鉴定SD大鼠的脊髓NSCs,1×105/ml第3代NSCs置于Tran-swell小室下层与1×105/ml上层原代EPCs进行体外1∶1共培养,以单纯第3代的NSCs培养为对照,培养7 d,双盲法分别计数各组在相差显微镜下神经球形成的数目,并用目镜测微尺测量神经球的平均直径,通过5%血清诱导培养NSCs 7 d后,行β-微管蛋白-Ⅲ免疫荧光染色,Hoechst细胞核染色后在显微镜下计算神经元/细胞总数得出百分率。结果骨髓源性EPCs与脊髓源性NSCs共培养组神经球平均数目为(22．27±3．85)个,平均直径为(61．70±7．21)μm,诱导培养后分化为神经元的平均百分率为(46．10±3．70)%,与对照组比较差异均有统计学意义( P<0．01)。结论骨髓源性EPCs能促进脊髓源性NSCs增殖及其向神经元分化。     

自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响

目的：分析自体浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)对比格犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖及成骨向分化的影响。方法：取健康比格犬脂肪组织进行分离、培养ADSCs并鉴定其多向分化潜能,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖。将ADSCs分为CGF组及对照组,对两组细胞进行成骨诱导后分别检测其碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR法检测I型胶原(Col-I),Runx2等成骨相关基因表达。结果：CGF组细胞增殖能力明显高于对照组(P<0.05);经成骨诱导的ADSCs在CGF作用下ALP活性明显增强(P<0.05),Col-I,Runx2等成骨相关基因的表达亦明显高于对照组(P<0.05)。 结论：CGF能够促进ADSCs体外增殖和成骨向分化。     

Telmisartan promotes proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via activation of Akt

Background Numerous studies have demonstrated that the peroxisome proliferator-activated receptor-y （PPARy） plays an important role in regulating endothelial progenitor cells （EPC） function.Telmisartan,as a partial agonist of PPARy,may have an effect on the regulation of EPC functions.The purpose of this study was to investigate the effects of telmisartan on EPC proliferation and differentiation.Methods Peripheral blood derived mononuclear cells containing EPC were isolated from healthy volunteers and then cultured on flbronectin-coated dishes in the presence or absence of telmisartan.The proliferative activity of EPC was determined by colony forming units （CFU） and MTT assay.The migratory activity of EPC was assessed by transwell assay.The expression of endothelial cells （EC） markers,including vascular endothelial cadherin （VE-cadherin）,yon Willebrand factor （vWF） and endothelial nitric oxide synthase （eNOS）,were measured by Western blotting analysis.Results Morphological analysis revealed that telmisartan significantly increased the proliferation of EPC and the number of endothelial cell colony forming units.Telmisartan could enhance the expression of the makers of mature EC,including VE-cadherin,vWF,and eNOS,which indicated telmisartan could stimulate EPC to differentiate into mature EC.Telmisartan increased the phosphorylation of Akt in EPC.The inhibition of Akt activation significantly attenuated the effect of telmisartan on EPC functions,suggesting that Akt is involved in the stimulatory effect of telmisartan on EPC differentiation.Conclusions The results of this study demonstrate that telmisartan promotes EPC functions via activation of Akt.